番茄叶霉病高抗基因Ｃｆ－９的ＣＡＰＳ标记创建

陈丽静　李天来　李君明　宋　燕　王玉昆　王孝宣　徐合金

摘要根据番茄叶霉病高抗基因Cf-9的基因序列设计3对特异扩增引物，以近等基因系和本组的多重PCR检测材料为试材，扩增cf-9基因1～2867bp之间的单拷贝片段，3对引物分别扩增出560bp，1 000bp，1 080bp的特异片段。分别用限制性内切酶TaqI，HindⅢ，HinfⅠ，EcorⅠ酶切，限制性内切酶Taq工酶切特异引物SCARl扩增的560特异片段具有酶切多态性，抗病品种酶切出450 bp，330 bp，290 bP的特异片段，感病品种酶切出450 bp，290bp的特异片段。初步建成番茄叶霉病高抗基因cf-9的CAPS标记，经近等基因系及其杂交种检验，结果稳定可靠，可用于番茄cf-9抗病基因辅助选育。

关键词番茄；叶霉病；C9基因；CAPS标记

中图分类号S 432．23

番茄是全世界产量最高的30种农作物之一，其年产量除马铃薯外远远高出其他蔬菜作物。每年由于病虫危害，经常造成全世界番茄大面积减产。番茄生产上经常发生的病害已达40多种，其中番茄叶霉病[Fuluia fulva(Cook)]就是一种番茄生产中普遍发生的病害。叶霉病对保护地番茄生产危害尤为突出。随着保护地番茄种植面积的扩大及连作时间的延长，该病的危害也日趋严重。番茄叶霉病发病率很高，此病一旦出现，迅速传播蔓延。番茄叶霉病给番茄生产带来了不可低估的影响。1883年，英国首次报道了番茄叶霉病的发生。从此以后，世界各国的科学工作者已对番茄叶霉病的特征特性，抗源的筛选、抗病遗传及抗性机制等诸多方面进行了较为全面的研究。抗病基因是抗病育种的基础，随着生物技术的发展，人们应用遗传图谱和分子标记技术，对番茄抗叶霉病基因进行定位和遗传学研究，已有多个抗性基因被克隆出来，部分基因的结构、功能和抗病机制已明确，有的已经被利用在分子育种上，这为生产上有效控制番茄叶霉病提供了一条新途径。本文根据已发表Genbank中Cf—9基因的基因序列，创建了番茄叶霉病高抗基因Cf-9的CAPS标记，可用于番茄Cf—9抗病基因辅助选育。

1材料与方法

1．1试材

本试验所用番茄Moneymaker、Motelle、Movi-one、Mobaci、Moperou、Mospomor、Mogeor等试材由法国农业科学院(INRA)蔬菜果树遗传研究所提供，它们均是以Moneymaker为遗传背景含有不同抗病基因的近等基因系，其中对番茄叶霉病的抗性基因型详列于表1。2000年秋，利用上述材料配制了MotelleXMovione、Mogeor×Movione和Mogeor×Motelle等3个杂交组合。LA3047是从美国番茄遗传中心(TGRC)引入的含有CF-9基因的材料。番茄CLN2037E试材是从亚洲蔬菜研究发展中心(AVRDC)引入的含有抗晚疫病Ph-3基因的新材料，AilsaCraig是从美国番茄遗传中心(TGRC)引入的番茄试材，92155为本组选育出的优良加工类型新品系，00383X 92155为从保加利亚遗传研究所引入的含有雄性不育ps-2基因的新材料与本组92155杂交得到的杂种一代。

1．2引物设计

根据已发表的Cf-9基因的基因序列(GenBankaccessionnumberUl5936)，该基因全长2 867 bp，利用DNAMANversion 4．0(Primer 3．0)软件设计特异扩增的3对PCR特异引物，扩增Cf-9基因1—2867bp之间的单拷贝片段，3对引物分别为SCARlR： ATCCAACAAGATGATTGTGAGA-GA， SCARlF： CAAACTGGTTGC,GATAC-CTATTTC；SCAR2R：ATCCAACAAGATGATT—GTGAGAGA， SCAR2F：ACTAAACCACTT-GAATGC~AGTAT；SCAR3R：GTGGTCAACT—-CAATATCCAGCA，SCAR3F：TGGTTGAGAG——GAACGAATACCT；引物序列及不同基因型材料的特异性扩增片段详见表2。引物均由上海生物工程技术公司合成。

1．3DNA提取

所有试材播种于温室，待幼苗长出2～3片真叶时取叶片提取DNA。提取方法参照Williamson等(1994)方法，由CTAB法提取，琼脂糖电泳法检测DNA浓度，然后贮备在-20℃的冰箱中备用。用于PCR反应的全部药品购自上海普洛麦格生物技术工程有限公司。

1．4PCR扩增体系

PCR反应总体系为25μL，包括Buffer 2．5 μL、dNtPs各0．1mmol／L、Mg²⁺的浓度为1．5mmol／L、引物0．2tanol／L、Tap酶1．0U、模板DNA为20ng,终体积用水加至25μL。用于扩增含有cf9基因的PCR反应程序为：92℃变性3min然后92℃ 30s、56℃1min，72℃30s循环30次；最后72℃延伸8min，扩增产物贮藏在4℃保存。PCR产物用1．5％琼脂糖凝胶在5v／cm电压条件下电泳2h，终结果用EB染色，Bio-RAD凝胶成像系统成像显示。

1．5限制性内切酶酶切反应

1．5．1TaqI酶切反应20／μL体系，7μL PCR扩增产物、2μL bufferE，1μL TaqI(Promage)，0．2bLl％BSA，用ddH20补足体积。65‘C保温1．5～2．0h，然后加入loadingbuffer终止反应，用1．5％琼脂糖凝胶在5V／cm电压条件下电泳2h，终结果用EB染色，Bio-RAD凝胶成像系统显示。

1．5．2HindⅢ酶切反应

20rtl体系，7μL PCR扩增产物、2 μL buff—erM，lμL HindⅢ(Promage)，0．2 μL l％BSA，用ddH₂O补足体积。37℃保温4．0～6．0h，然后加入loading buffer终止反应，用1．5％琼脂糖凝胶在5 V／cm电压条件下电泳2 h，终结果用EB染色，Bio-RAD凝胶成像系统显示。

1．5．3HinfI酶切反应

20lμL体系，7μL PCR扩增产物、2 μL buff—err，1μL HinfI(Promage)，0．2μL 1％BSA，用ddH₂O补足体积。37℃保温4．0～6．0h，然后加入loadingbuffer终止反应，用1．5％琼脂糖凝胶在5v／cm电压条件下电泳2 h，终结果用EB染色，Bio-RAD凝胶成像系统显示。

1．5．4EcorI酶切反应

20μL体系，7μLPCR扩增产物、2rtlbuffe—rO，l taL EcorI(Promage)，0．2 rtl 1％BSA，用ddH20补足体积。37℃保温4．0～6．0h，然后加入loadingbuffer终止反应，用1．5％琼脂糖凝胶在5V／cm电压条件下电泳2 h，终结果用EB染色，Bio-RAD凝胶成像系统显示。

2结果与分析

2．1特异引物的扩增结果

以15个含不同抗性基因的番茄叶霉病鉴别寄主品种总基因组DNA为模板，用本研究设计并合成的3对特异引物进行PCR扩增，所有的材料分别扩增出条带，3对引物无论是抗病材料还是感病材料分别扩增出560bp，1 000 bp，1 080 bp的特异片段，3个片段大小分别与Cf-9基因中两对应引物之间的片段大小吻合，因此可以推断引物设计及扩增程序是可行的，所扩增的应该是Cf-9基因或其等位基因的单拷贝片段。

2．2 Cf-9基因CAPS标记的获得

利用限制性内切酶TaqI，HindⅢ，HinfI，Ecorl分别对该3对特异引物的扩增片段进行酶切，只有限制性内切酶TaqI酶切特异引物SCARl扩增的560 bp特异片段具有酶切多态性，而其他组合不具酶切多态性。利用SCARl正反引物扩增全部试材，无论是抗病材料还是感病材料均扩增出560 bp的特异性片断，经TaqI酶切后(图1a、b)，抗感病材料均存在酶切位点，其中抗病基因型LA3047抗病材料分别产生了450bp、330bp和290 bp大小的特异性片断，而其余的感病基因型共14份材料分别产生了450 bp和290 bp大小的特异性片断。经近等基因系及其杂交种多次检验，结果稳定可靠，可用于番茄Cf-9抗病基因辅助选育。

3讨论

分子标记选择是农作物分子育种的关键技术。在已知基因序列的情况下，要建立简便、稳定、可靠的标记选择体系，往往要针对基因单拷贝或低拷贝的序列进行扩增，一般情况下，抗病基因之间具有极高的同源性，抗病基因与其等位基因也具有很高的同源性，单用特异引物扩增，利用琼脂糖凝胶电泳，将难以检测这些差异，但是同源序列间往往存在一些碱基变异，限制性内切酶可以识别单个碱基的差异，利用酶切位点的多态性即可建立抗病基因的CAPS标记。CAPS标记作为PCR和酶切技术相结合的分子标记技术，可以从单个的碱基差异进行分别，这为创建稳定可靠的共显性标记提供了一条捷径，在标记辅助选择育种中具有广阔的应用前景。

随着染色体技术和分子标记技术用于番茄抗病基因定位以来，有关叶霉病抗性基因的遗传及染色体定位研究取得了很大的进步。番茄叶霉病抗性受显性单基因控制，抗病性为显性，属于垂直抗性，大多表现为质量性状遗传。Kerr和Bailey在1964年将Cf-1基因定位于番茄1号染色体。研究结果还表明，Cf-4和Cf-9基因紧密连锁，位于1号染色体短臂上：9)，C2和Cf-5紧密连锁，位于6号染色体臂上。Cf-1，Cf-2，Cf-4，Cf-5及Cf-9的连锁图可以在http：／／gerec．ifas．ufl．edu／tgc／newslet—ters／vol42／v422p19．html网址找到。CECP2被定位在1号染色体上，与Cf-4／Cf-9紧密连锁。1980年Kanwar等把所有24个抗叶霉病基因已全部定位于番茄12条不同的染色体，对这24个基因在染色体上的定位及分离仍在继续进行。其中Cf-10，Cf-16，Cf-12，Cf-21这4个基因在染色体上的位点又有了新的变更。随着AFLP技术的出现，Thomas等用BSA(bulked segregant analysis)方法，利用番茄与野生种匀copersiconpennellii种间杂交F，群体发现42 000条AFLP带与番茄抗叶霉菌基因Cf-9紧密连锁，其中3个标记(M1，M2，Ma)与Cf-9基因表现共分离。Laugh等发现在Cf-9基因片断附近还存在一个甚至数个对叶霉病表现抗性的基因，但抗病性比Cf-9弱，这可能是Cf-9基因至今仍未被叶霉病病原菌克服的原因。1993年Cf-9基因被克隆，这一成果为本研究CAPS标记的建立奠定了基础。本研究利用Cf-9基因的Gen—bank基因序列创制分子标记，所获得的CAPS标记与抗病基因共分离，选择的稳定性与可靠性将明显优于前者，这将为Cf-9基因的分子标记辅助育苗提供高效选择手段。