山东鸭源粪肠球菌的分离鉴定及药物敏感性分析

摘 要：为探究引起山东省某规模肉鸭养殖场雏鸭死亡的原因，本试验在病死鸭病变肝脏组织中分离到疑似粪肠球菌病原菌。通过细菌分离培养、形态观察、生化试验鉴定、16S rRNA序列分析鉴定病原菌，对分离菌进行抗菌药物敏感性试验，以便精准用药防控。结果显示：分离菌为粪肠球菌，且该菌株多重耐药性较强，对阿莫西林、安普霉素敏感，对头孢噻肟、氟苯尼考、卡那霉素、恩诺沙星、氨苄西林、多黏菌素耐药。本研究为鸭源粪肠球菌的临床防控提供了参考依据。

关键词：粪肠球菌；分离鉴定；序列分析；最小抑菌浓度

收稿日期：2024-08-03

第一作者：刘洪港（1997—），男，从事家禽疫病诊断与防治工作，E-mail：LHG2013614@163.com

并列第一作者：张筱（1997—），女，从事家禽疫病诊断与防治工作，E-mail：Zxxx2920@163.com

通信作者：汪建华（1993—），男，主要从事种禽疫病诊断与防治技术研究：E-mail：739322897@qq.com

粪肠球菌（Enterococcus faecalis，Ef）作为一种广泛存在于人类、动物肠道及自然环境中的革兰氏阳性兼性厌氧菌，机体健康状态下也可稳定地定植于胃肠道、口腔或生殖道内[1]。粪肠球菌作为具有多种益生功能的菌群之一，能够促进消化、增强免疫力及降低腹泻发病率，具有一定的治疗效果，而且还在肠道中发挥着调节菌群平衡、维持肠道菌群稳态的关键作用[2]。此外，粪肠球菌能有效提高家畜的抵抗力和生产性能，通过抑制大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌的生长，显著改善肠道微环境。有研究表明，仔猪口服粪肠球菌能显著降低腹泻率并增加平均日增重。

粪肠球菌作为禽类肠道正常菌群的组成部分，通常并不会引起疾病。然而，在特定的条件下如受到应激、营养不良、饲养环境恶劣等因素的影响下，粪肠球菌可能会大量繁殖，导致感染的发生[3]。因此，一般认为粪肠球菌感染是继发性的，即在其他疾病或因素导致鸭免疫力下降的情况下，粪肠球菌才会趁机侵入机体，引发感染[4-5]。近年来，由粪肠球菌引起的人及动物感染、死亡的病例逐渐增多[6-7]。例如，粪肠球菌能引发人的传染性心内膜炎，也能导致鸡、鹅败血症、公猪睾丸炎及家兔腹泻等多种疾病。值得注意的是，这种病原菌具有在人与动物之间水平传播的能力，因此对其防控尤为重要。

本研究从山东省某规模肉鸭养殖场的病鸭肝脏组织中分离培养细菌，通过细菌形态观察、生化鉴定、16S rRNA序列分析，鉴定分离菌为鸭源粪肠球菌，并通过药物敏感性试验分析分离菌株的耐药性特点，以期为鸭源粪肠球菌防控提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 病料来源于山东省某规模肉鸭养殖场17日龄病死雏鸭。

1.1.2 主要仪器与试剂 医用洁净工作台，济南鑫贝西生物技术有限公司；生化培养箱，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；N-300M显微镜，宁波永新光学股份有限公司；营养琼脂，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；2×PCRmix，南京诺唯赞生物科技有限公司；DNA Marker、核酸染料，北京康润诚业生物科技有限公司；革兰氏染色试剂盒，金克隆（北京）生物技术有限公司；小牛血清，平睿生物科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 剖检与细菌分离 无菌采集病死鸭的肝脏、脾脏，接种至含有5%胎牛血清的营养琼脂培养基上，置于37 ℃恒温培养箱培养24 h，观察菌落的生长形态。挑选出单一菌落革兰氏染色，显微镜下观察其形态特征。对疑似菌落，则进一步纯化培养。

1.2.2 生化鉴定 为确定分离菌株特性，将纯化培养后的产物接种至不同细菌生化微量鉴定管中，包括葡萄糖、枸橼酸盐、尿素、麦芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖。此外还测试了菌株V-P、M-R试验特性。接种后的样本，37 ℃恒温培养24～48 h。依据《伯杰细菌鉴定手册》的标准，对培养结果进行判定。

1.2.3 16S rRNA序列测定 从分离纯化后的菌株中挑选目标菌，按照细菌总DNA提取试剂盒的规范步骤，提取纯化菌株总DNA。16S rRNA基因引物序列：正向引物5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，反向引物5’-TACGGYTACCTTTGACGACT T-3’，预期PCR产物条带大小为1 500 bp。PCR扩增采用50 μL反应体系，包括25 μL Premix Ex Taq、上下游引物各1 μL、20 μL去离子水、3 μL菌液。反应程序：95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循环30次；最后72 ℃延伸8 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察记录结果，并将回收的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。利用NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）对测序结果进行同源性分析，选取与已知菌株同源性较高的16S rRNA基因序列，借助DNAstar同源性分析，利用MEGA 11.0.10软件构建分离菌株的系统进化树。

1.2.4 抗菌药物敏感性试验 参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）所确立的微量肉汤稀释法，测试分离菌的药物敏感性，精确测量8种不同药物的最小抑菌浓度（MIC）。依据CLSI标准，对药敏结果评估。

2 结果

2.1 细菌分离培养

无菌采集病死鸭的肝脏、脾脏，接种至含有5%胎牛血清的营养琼脂培养基，置37 ℃恒温培养箱培养24 h，结果培养基上生长呈乳白色或灰白色、光滑且边缘整齐的圆形或近似圆形的菌落，见图1；革兰氏染色、1 000倍镜下观察，分离菌为革兰氏阳性、单个菌体疏松分布或个别短链状排列，见图2。分离菌株与粪肠球菌形态特性观察一致。

2.2 生化鉴定

分离菌株的生化鉴定结果显示，该菌株可发酵麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇，M-R试验结果为阳性，过氧化氢、V-P试验结果阴性，符合粪肠球菌生化特征。生化试验结果见表1。

2.3 16S rRNA 基因序列同源性分析

将16S rRNA PCR扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。利用GenBank进行Blast序列对比，选取8段合适的基因序列作为参考；另外选取大肠杆菌、沙门氏菌16S rRNA片段作为参考对照，利用DNAstar软件同源性分析，此分离菌株16S rRNA 序列与粪肠球菌的同源性达到98%以上，结果见图3。

2.4 16S rRNA鉴定及序列分析

利用GenBank进行Blast序列对比，进一步利用MEGA11.0.10软件深入分析和构建系统进化树，显示此分离菌株与GenBank 登录号MN880256.1处于统一分支上，亲缘关系较近，结果见图4。

中图分类号：S858.32 文献标识码：A 文章编号：1673-1085（2025）02-0026-06

2.5 药物敏感性结果

分离菌株药物敏感性结果见表2所示。该菌株多重耐药性较强，对阿莫西林、安普霉素敏感，对头孢噻肟、氟苯尼考、卡那霉素、恩诺沙星、氨苄西林、多黏菌素耐药。

3 讨论

临床剖检可见病鸭患肝周炎、气囊炎，心包内充满黄色脓性液体并伴有纤维素性渗出物，这些病理变化与粪肠球菌感染特征相吻合。本试验从肝脏组织病料中成功分离到一株细菌，经培养特性观察、生化试验和16S rRNA PCR鉴定，证实分离出的菌株为粪肠球菌。药敏试验结果显示，该菌株多重耐药性较强，对阿莫西林、安普霉素敏感，对头孢噻肟、氟苯尼考、卡那霉素、恩诺沙星、氨苄西林、多黏菌素耐药。吴云等[8]分离的粪肠球菌对万古霉素、替考拉宁敏感；夏伦斌等[9]分离的粪肠球菌对头孢噻肟、磷霉素、丁胺卡那等药物敏感，对多西环素、卡那霉素、新霉素、氟苯尼考等耐药；刘雨[10]研究表明61株鸡源粪肠球菌多重耐药菌株检出率高达72.13%，优势耐药谱是E-TE-S-CN（19.68%）。粪肠球菌多重耐药性可能是由于长期在复杂化的养殖场环境中针对不同种类的动物治疗时，频繁采用多样化的抗菌药物策略，导致出现粪肠球菌耐药性的复杂局面。鉴于此，兽医临床中，为了在治疗初期对病原菌进行精准用药，故对分离菌进行药敏测试，以了解其对不同药物的敏感性。

粪肠球菌在禽畜养殖中是一种常见的条件性致病菌，尤其在环境卫生条件不佳、饲养管理不当的情况下更容易诱使鸭群感染粪肠球菌。粪肠球菌的传播途径广泛，可通过空气、饮水、饲料、接触传播等多种方式感染畜禽。为有效防控粪肠球菌病，可采取一系列措施：首先，提高畜禽的免疫力是关键，可通过合理的饲养管理和营养补充来增强畜禽的抵抗力；其次，加强养殖环境的卫生管理，定期清洁和消毒禽舍，减少病原体的滋生和传播；注意饲料和饮水的卫生质量，避免污染；再次，人员管理也至关重要，养殖人员应具备良好的卫生意识，遵守养殖规范，避免将病原体带入禽舍；最后，加强野鸟和昆虫的控制，防止其成为粪肠球菌的传播媒介。综上所述，提高畜禽免疫力、加强养殖管理和改善环境卫生，可有效防控粪肠球菌病的发生和传播，保障畜禽的健康和养殖业的稳定发展。

参考文献：

[1]CHEN K J， LAI C C， CHEN H C， et al. Enterococcus faecalis endophthalmitis： Clinical settings， antibiotic susceptibility， and management outcomes [J]. Microorganisms， 2021， 9（5）： 918

[2] 宋乐辉.鸡源性粪肠球菌的分离及益生特性研究[D].南昌：江西农业大学，2023.

[3] 吴定洲，王永贞，冉恒东，等.一株禽源粪肠球菌的分离与鉴定[J].天津农学院学报，2024，31（1）：78-82.

[4] 周改玲，乔宏兴.番鸭感染粪肠球菌与沙门氏菌的分离鉴定、遗传进化及耐药基因检测分析[J].家畜生态学报，2023，44（10）：82-88.

[5] 刘云，徐小艳，陈昌海，等.一例由粪肠球菌感染引起的鸭死亡病例诊断[J].中国动物检疫， 2022，39（12）：128-131.

[6] 陈松，马启超，鲍佳茵，等.一株鸡源粪肠球菌的分离鉴定[J].北方牧业，2024（5）：19.

[7] 狄婷婷，高原，聂鑫，等.致鹅败血症粪肠球菌的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2012，34（3）：192-196.

[8] 吴云，陈家炜，王瞳，等.16种抗菌药物对临床分离的金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌体外抗菌活性：全国多中心横断面研究[J].协和医学杂志，2023，14（5）：999-1004.

[9] 夏伦斌，郑秋润，陈存武，等.雏鸡源致病性粪肠球菌的分离鉴定及其耐药性分析[J].微生物学通报，2021，48（5）：1626-1636.

[10]刘雨.泰安地区禽源粪肠球菌的分离鉴定及耐药性研究[D].泰安：山东农业大学，2021.

Isolation， Identification and Drug Sensitivity Analysis of

Enterococcus faecalis from Duck Source in Shandong Province

LIU Honggang1， ZHANG Xiao1， ZHAO Jie1， SHI Yanhong1，WANG Zhen1， LI Yufeng2，

WANG Jianhua1

（1. Shandong Hekangyuan Biological Breeding Co.， Ltd.， Jinan 250100，China;

2. Poultry Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences/Poultry Breeding and Disease Prevention and Control Shandong Engineering Research Center， Jinan 250100，China）

Abstract： To investigate the etiology of duck mortality in a duck farm located in Shandong Province， pathogenic bacteria suspected to be Enterococcus were isolated from the liver tissues of deceased ducks. For precise pharmacological intervention， a comprehensive approach was employed， including bacterial isolation， morphological observation， biochemical testing， and 16S rRNA sequence analysis for pathogen identification. Additionally， drug sensitivity assays were performed on the isolated pathogens. The results indicated that the isolated strain was identified as Enterococcus faecalis， exhibiting significant multi-drug resistance. The strain demonstrated sensitivity to Amoxicillin and Ampramycin， while showing resistance to Cefotaxime， Flufenicol， Kanamycin， Enrofloxacin， Ampicillin， and Polycolistin. This study offers valuable insights for the clinical prevention and control of Enterococcus faecalis originating from ducks.

Keywords： Enterococcus faecalis; Isolation and identification; Sequence analysis; MIC