ARTP诱变选育高产腺苷菌株及发酵条件优化

摘要：为获得高产腺苷菌株，实现降本增效，该研究基于一株腺苷产生菌枯草芽孢杆菌SB-37，对其进行ARTP诱变选育，采用单因素实验和响应面方法优化菌株发酵条件。结果表明，最佳处理时间为30 s，菌株诱变致死率为98.75%。比对初始菌株腺苷产量，获得8株高产腺苷突变株，其中菌株Q40-2-37腺苷产量最高，为6.20 g/L，是出发菌株的2.58倍。该菌株最适发酵条件为葡萄糖99 g/L、蛋白胨25 g/L、pH 7.04、接种量8.03%、发酵时间72 h，此条件下，腺苷产量为6.92 g/L。该研究结果为高产腺苷菌株的诱变选育和发酵条件的优化提供了技术支撑。

关键词：腺苷；枯草芽孢杆菌；常压室温等离子体；诱变；发酵条件优化

中图分类号：TS201.3""""" 文献标志码：A""""" 文章编号：1000-9973（2024）08-0063-06

Breeding of High-Producing Adenosine Strains by ARTP Mutation and

Optimization of Fermentation Conditions

YAN Geng-xuan1， LIU Wei1， LIU Chun-yan2， TIAN Yuan1， YU Chong1，

JIANG Wei1， TIAN Jie-ping1*， ZHANG Shu-mei1*

（1.Institute of Microbiology， Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin 150010， China;

2.Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin 150001， China）

Abstract： In order to obtain high-producing adenosine strains and realize cost reduction and efficiency enhancement， a strain of adenosine-producing bacterium， Bacillus subtilis SB-37， is breeded by ARTP mutation， and single factor experiment and response surface method are used to optimize the fermentation conditions of the strain. The results show that the optimal treatment time is 30 s and the mutation fatality rate is 98.75%. Compared with the adenosine yield of the original strain， 8 high-producing adenosine mutant strains are obtained， and strain Q40-2-37 has the highest adenosine yield of 6.20 g/L， which is 2.58 times that of the original strain. The optimal fermentation conditions of the strain are glucose of 99 g/L， peptone of 25 g/L， pH of 7.04， inoculation amount of 8.03% and fermentation time of 72 h.Under these conditions， the adenosine yield is 6.92 g/L. The results of this study have provided technical support for the mutation and breeding of high-producing adenosine strains and optimization of fermentation conditions.

Key words： adenosine; Bacillus subtilis; atmospheric and room temperature plasma; mutation; optimization of fermentation conditions

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.08.012

引文格式：闫更轩，刘伟，刘春燕，等.ARTP诱变选育高产腺苷菌株及发酵条件优化.中国调味品，2024，49（8）：63-68.

YAN G X， LIU W， LIU C Y， et al.Breeding of high-producing adenosine strains by ARTP mutation and optimization of fermentation conditions.China Condiment，2024，49（8）：63-68.

收稿日期：2024-01-26

基金项目：黑龙江省省属科研院所科研业务费项目（CZKYF2023-1-B041）

作者简介：闫更轩（1996—），男，助理研究员，硕士，研究方向：工业菌种选育。

*通信作者：田洁萍（1971—），女，高级工程师，研究方向：科技管理；

张淑梅（1969—），女，研究员，博士，研究方向：食品微生物。

呈味核苷酸作为一种新型调味品，在食品行业中应用广泛，海鲜、蘑菇等食品中含有丰富的核苷酸，主要包括肌苷酸、鸟苷酸和腺嘌呤核苷酸。腺嘌呤核苷酸是一种苦味阻滞食品添加剂，由于成本高，尚未得到广泛应用。腺苷又叫腺嘌呤核苷，是一类具有重要生物学功能的核苷酸衍生物，不仅是制造阿糖腺苷、腺苷三磷酸与环磷酸腺苷等核苷类药物的重要中间体，而且是制造食品呈味剂腺嘌呤核苷酸的重要原料，在医药和食品领域的商业价值巨大。腺苷生产主要有化学、酶解和微生物发酵3种方式。化学合成法由于合成工艺相对复杂、成本较高且提取率低，不适用于大规模工业化生产。酶解法受酶成本和提纯工艺的限制，已经退出市场。微生物发酵法是目前首选的腺苷生产方式，提高菌株发酵能力是腺苷行业急需解决的共性问题。

常压室温等离子体（ARTP）作为微生物诱变育种新技术已广泛应用于工业菌株的改造，通过诱变育种获得高产腺苷的优良底盘菌，基因工程改造和发酵工艺优化是提高腺苷产能、实现降本增效的重要途径。本研究基于一株腺苷产生菌枯草芽孢杆菌SB-37，通过等离子体诱变技术，旨在获得一株腺苷产量高且遗传稳定的诱变菌株，采用单因素实验和响应面分析对诱变菌株进行培养基组分和发酵条件优化，以期进一步提高腺苷产量，该研究为利用基因工程技术改造腺苷产生菌提供了菌株资源，为腺苷的发酵生产提供了技术参考。

1" 材料与方法

1.1" 材料

枯草芽孢杆菌SB-37：保存于黑龙江省科学院微生物研究所菌种保藏中心。

1.2" 主要试剂

腺苷标准品：购自北京索莱宝科技有限公司；蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、琼脂等试剂：购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.3" 主要仪器与设备

ARTP诱变育种仪" 无锡源清天木生物科技有限公司；TU-1901紫外可见分光光度计" 北京普析通用仪器有限责任公司；ZQLY-300V恒温摇床" 上海知楚仪器有限公司。

1.4" 培养基

LB培养基：蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，pH 7.0，120 ℃灭菌15 min。

固体培养基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母膏1%，牛肉膏0.3%，尿素0.5%，氯化钾0.2%，琼脂1.5%，pH 7.0，120 ℃灭菌15 min。

种子培养基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母膏1%，牛肉膏0.3%，尿素0.5%，氯化钾0.2%，泡敌0.03%，pH 7.0，120 ℃灭菌15 min。

发酵培养基：葡萄糖7%，蛋白胨2.5%，磷酸二氢钾0.3%，七水硫酸镁0.1%，尿素0.5%，氯化钾0.2%，硫酸铵1.5%，一水硫酸锰0.001%，硫胺素0.015%，豆饼粉水解液1.5%，pH 7.0，120 ℃灭菌15 min。

1.5" 方法

1.5.1" ARTP诱变

用LB 液体培养基培养枯草芽孢杆菌SB-37至对数生长期，离心收集菌体，用无菌水重悬使菌浓度为106～108 个/mL，在超净台上取10 μL菌液均匀涂布在无菌载片表面，用无菌镊子将载片放到ARTP诱变仪对应凹槽中，按以下参数处理：电源功率120 W，作用距离 2 mm，气流速度 10 SLM，分别照射20，30，40，50，60，80，100 s，以无照射作为对照。照射后，用无菌镊子将载片放置于无菌水中洗脱，适当稀释后涂布于LB培养皿。于30 ℃培养24 h后，计算菌落数，根据致死率筛选合适的诱变时间。致死率（%）=（对照活菌数-处理活菌数/对照活菌数）×100%。

1.5.2" 高产腺苷菌株的筛选

依次挑取单菌落接种到 10 mL种子培养液中，在30 ℃、200 r/min条件下振荡培养72 h，取发酵上清液在水浴锅中煮沸5 min，以8 000 r/min离心5 min。取1 μL上清液加入1 mL 0.1 mol/L pH 3的盐酸溶液，混匀，在260 nm波长下测定OD260 nm吸光度。通过腺苷标准品的标准曲线计算腺苷产量。

1.5.3" 单因素实验

通过单因素实验研究碳源葡萄糖的添加量、氮源尿素和蛋白胨的添加量、接种量、发酵时间、培养基初始pH等因素对腺苷产量的影响，筛选出主要影响因素，进行响应面分析。单因素实验设计见表1。

1.5.4" Box-Behnken设计

基于单因素实验结果，以葡萄糖添加量（A）、初始pH（B）和接种量（C）为因素设计三因素三水平实验，优化所选突变株的腺苷生产能力，Box-Behnken设计见表2。

1.5.5" 数据处理

全部实验进行3次生物学重复，应用SPSS Statistics 26.0软件对所有数据进行处理，结果以平均值±标准差表示，采用Origin 2021软件绘图，使用Design-Expert 12软件进行响应面相关结果分析。

2" 结果与分析

2.1" ARTP诱变时间对菌株生存的影响

ARTP处理时间是影响菌株生存和诱变效果的主要因素，菌株致死率与照射时间呈正相关，延长照射时间，菌株致死率提高。由图1可知，照射处理20 s时诱变致死率为89.50%，照射处理 60 s时诱变致死率达到100%。ARTP诱变处理时间的选择因菌株而异，研究表明，诱变时间过长会导致枯草芽孢杆菌产生不可逆的DNA损伤，无法进行自我修复。本研究中枯草芽孢杆菌SB-37在通气量10 SLM、功率120 W、照射距离2 mm的条件下，处理时间为30 s时诱变致死率已经达到98.75%，远远高于杨心萍等的约60%，推测与诱变处理操作方式或菌种特性有关。

2.2" 突变菌株的筛选

将不同处理时间下的单菌落进行液体培养后测定腺苷含量，从1 642个菌株中获得131个腺苷产量较高的正突变菌株，正突变率为7.97%，有8个菌株腺苷产量显著提高，见表3。其中编号为Q40-2-37的菌株产量最高，为6.20 g/L，是原始菌株的2.58倍。对Q40-2-37菌株进行传代培养5次后，菌株生长稳定，其腺苷产量在5.86～6.20 g/L之间，表明Q40-2-37菌株的遗传性能较稳定。

2.3" 发酵工艺优化

2.3.1" 单因素实验

2.3.1.1" 碳源添加量对腺苷产量的影响

比较了在相同发酵条件下葡萄糖的添加量对Q 40-2-37菌株腺苷产量的影响，结果见图2。

由图2可知，当葡萄糖添加量为50～90 g/L时，腺苷产量随着葡萄糖添加量的增加而升高，当葡萄糖添加量为90 g/L时腺苷产量达到最大，为6.46 g/L。当葡萄糖添加量大于90 g/L时，腺苷产量不再上升，反而略有下降。批次发酵葡萄糖浓度过高，培养液的黏度增加，传质能力和溶解氧降低，渗透压增大，影响芽孢杆菌的生长和初级代谢物的产量。葡萄糖添加量为90 g/L最适合Q40-2-37菌株产生腺苷。

2.3.1.2" 氮源添加量对腺苷产量的影响

枯草芽孢杆菌发酵一般应用复合氮源，本研究参考杨心萍等的报道，选用尿素与蛋白胨作为培养基氮源。固定培养基中尿素含量为5 g/L，比较了相同发酵条件下蛋白胨的添加量对Q40-2-37菌株腺苷产量的影响，结果见图3。

由图3可知，初期蛋白胨浓度较低时，随着蛋白胨添加量的增加，Q40-2-37菌株的腺苷产量随之增大，当蛋白胨添加量达到30 g/L时，继续添加蛋白胨，腺苷产量基本保持不变，因此考虑综合应用成本，选择蛋白胨的最佳添加量为30 g/L。

2.3.1.3" 接种量对腺苷产量的影响

接种量直接影响发酵液中后期菌体含量，是影响初级代谢物发酵水平的重要因素。比较了相同发酵条件下不同接种量对Q40-2-37菌株腺苷产量的影响，结果见图4。

由图4可知，初期接种量较低时，随着接种量的增加，Q40-2-37菌株的腺苷产量随之增大，当接种量达到8%时，腺苷产量达到最高，为6.13 g/L，继续升高接种量会使腺苷产量下降，故选择8%为最佳接种量。

2.3.1.4" 发酵时间对腺苷产量的影响

菌体的生长和代谢水平会随着发酵过程逐渐达到饱和，比较了在相同发酵条件下不同发酵时间对Q40-2-37菌株腺苷产量的影响，结果见图5。

由图5可知，菌株腺苷产量随着发酵时间的增加而升高，当发酵时间为24 h时，部分菌体仍处于生长期，此时腺苷产量较低，当发酵时间为72 h时，菌体生产腺苷的水平基本达到峰值，此时腺苷产量为5.84 g/L，而发酵时间为96 h和120 h时，检测到的腺苷产量变化较小。因此，选择最佳发酵时间为72 h。

2.3.1.5" 培养基初始pH对腺苷产量的影响

通过改变培养基初始pH明确在不同酸碱度条件下Q40-2-37菌株的腺苷产量，结果见图6。

由图6可知，pH为7.0时腺苷产量最高，为5.92 g/L，pH过高或过低均会使腺苷产量下降，这与杨心萍等的研究结果一致。因此，选择腺苷发酵的最佳培养基初始pH为7.0。

2.3.2" 响应面实验设计

基于单因素实验结果，以对腺苷产量影响较大的3个因素（葡萄糖添加量、初始pH、接种量）设计3个水平共17组实验，实验号6，9，11，14的腺苷产量较高，与其他实验号相比差异显著（见表4）。对A（葡萄糖添加量）、B（初始pH）、C（接种量）3 个单因素进行二次多项式回归拟合，构建响应值Y（腺苷产量）的回归模型方程：Y=6.86-0.053 7A+0.232 5B+0.043 8C+0.157 5AB-0.015 0AC-0.052 5BC-0.480 0A2-1.06B2-0.660 0C2。

对回归模型进行方差分析和差异显著性检验，见表5。

由表5可知，回归模型的F值为289.43（Plt;0.000 1），极显著；失拟项的F值为1.99（P=0.257 8），不显著，表明模型拟合良好。葡萄糖添加量（A）对腺苷产量的影响显著（Plt;0.05），初始pH（B）对腺苷产量的影响极显著（Plt;0.01），接种量（C）对腺苷产量的影响不显著（Pgt;0.05）；交互项AB对腺苷产量的影响极显著（Plt;0.01），AC、BC对腺苷产量的影响不显著（Pgt;0.05）；二次项A2、B2、C2对腺苷产量的影响均极显著（Plt;0.01）。

图7中响应面三维曲面图能够体现出A（葡萄糖添加量）、B（pH）、C（接种量）3 个单因素之间的交互作用对腺苷产量的影响。

由图7可知，3个因素对腺苷产量影响的显著性顺序为B（初始pH）＞A（葡萄糖添加量）＞C（接种量）。由回归模型推测的最佳发酵条件为葡萄糖添加量99 g/L、初始pH 7.04、接种量8.03%、发酵时间72 h、蛋白胨添加量25 g/L。

2.3.3" 最佳发酵条件的确定及验证

通过对所得模型进行分析，得到腺苷生产的最佳发酵条件为葡萄糖添加量99 g/L、初始pH 7.04、接种量8.03%、发酵时间72 h、蛋白胨添加量25 g/L，预测的腺苷产量为6.85 g/L。摇瓶实验验证得到腺苷产量为6.92 g/L，与预测值相近，表明该模型的拟合度较好，具有参考价值。

3" 结论

采用ARTP技术诱变选育高产腺苷菌株，获得8株产量较高的正突变菌株。采用单因素实验和响应面分析优化了腺苷产量最高的突变株的液体发酵条件为葡萄糖添加量99 g/L、蛋白胨添加量25 g/L、pH 7.04、接种量8.03%、发酵时间72 h，此条件下，腺苷产量为6.92 g/L，是出发菌株的2.93倍，比优化前提高了0.42 g/L。腺苷是生产核苷酸类食品呈味剂的重要原料，高产菌株是促进产业规模化发展的核心，本研究选育了一株产量比较高的菌株，未来将以该菌株为底盘菌，通过阻断组氨酸合成途径、增加腺苷代谢流等策略对菌株进行改良，以期进一步提高腺苷生产水平。

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