混合大孔树脂纯化蓝莓花青素及抗氧化性研究

摘要：研究混合大孔树脂对蓝莓花青素的纯化工艺条件，提高蓝莓花青素的抗氧化效果。比较 5种大孔树脂D101型、HP-20型、AB-8型、NKA-9型、D3520型对蓝莓粗提液的吸附效果。以吸附率和解吸率为评价指标，通过单因素试验和正交试验优化混合树脂分离纯化蓝莓花青素的吸附和解吸条件，分析纯化前后蓝莓花青素的抗氧化性，对比纯化前后花青素抗羟基自由基（·OH）和2，2-二苯基-1-苦基肼自由基（DPPH·）的差异。结果表明， D101型、HP-20型两种树脂按9∶1混合，混合树脂与蓝莓粗提液按1∶1吸附效果较好；当超声频率为40 kHz、吸附样液浓度为原样液、吸附时间为40 min、吸附温度为20 ℃时，吸附率达到96.2%；当上样量为5 mL、上样浓度为原样液、洗脱流速为1.0 mL/min、洗脱剂乙醇浓度为60%、洗脱剂体积为3 BV时，解吸率高达95.7%。采用混合树脂纯化的蓝莓花青素抗·OH和DPPH·均高于纯化前。纯化前后花青素对·OH的清除率分别为96.25%和97.85%，纯化前后对DPPH·的清除率分别为88.35%和93.20%。D101型、HP-20型混合树脂对蓝莓花青素的纯化效果良好，可用于蓝莓花青素的纯化；纯化后的蓝莓花青素抗氧化能力明显提高，能更好地清除·OH和DPPH·，且对·OH的清除效果高于DPPH·。

关键词：混合树脂；蓝莓花青素；分离纯化；抗氧化性

中图分类号：TS201.2""""" 文献标志码：A""""" 文章编号：1000-9973（2024）08-0193-07

Study on Purification of Blueberry Anthocyanins by Mixed Macroporous

Resins and Their Antioxidant Activity

WENG Xia1，2， WEI Wen-wen1，2

（1.College of Chemistry and Life Sciences， Anshan Normal University， Anshan 114007， China;

2.Key Laboratory of Development and Utilization for Active Molecules of Natural Products

in Liaoning Province， Anshan 114007， China）

Abstract： Purification process conditions of blueberry anthocyanins by mixed macroporous resins are studied to improve the antioxidant effect of blueberry anthocyanins.The adsorption effects of five macroporous resins such as D101， HP-20， AB-8， NKA-9 and D3520 on blueberry crude extract are compared. With adsorption rate and desorption rate as the evaluation indexes， the adsorption and desorption conditions for the separation and purification of blueberry anthocyanins by mixed resins are optimized through single factor test and orthogonal test.The antioxidant properties of blueberry anthocyanins before and after purification are analyzed， and the differences in hydroxyl free radicals （·OH） and 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazine free radicals （DPPH·） scavenging rates of anthocyanins before and after purification are compared. The results show that D101 and HP-20 resins are mixed in a ratio of 9∶1， and the adsorption

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.08.032

引文格式：翁霞，魏文文.混合大孔树脂纯化蓝莓花青素及抗氧化性研究.中国调味品，2024，49（8）：193-199，204.

WENG X， WEI W W.Study on purification of blueberry anthocyanins by mixed macroporous resins and their antioxidant activity.China Condiment，2024，49（8）：193-199，204.

收稿日期：2024-03-27

基金项目：辽宁省教育厅科学研究经费项目（面上项目）（2021LJKZ1164）；国家级大学生创新创业训练计划项目（202210169056）；鞍山师范学院校级本科教学建设与改革项目（202110309）；辽宁省天然产物活性分子开发及利用重点实验室科研项目（LZ202308）

作者简介：翁霞（1979—），女，内蒙古乌兰察布人，副教授，硕士，研究方向：天然产物的研究与应用。

effect is better when the ratio of the mixed resins to blueberry crude extract is 1∶1. When the ultrasonic frequency is 40 kHz， the concentration of adsorption sample solution is the original sample solution， the adsorption time is 40 min， and the adsorption temperature is 20 ℃， the adsorption rate reaches 96.2%. When the loading volume is 5 mL， the loading concentration is the original sample solution， the elution velocity is 1.0 mL/min， the eluent ethanol concentration is 60%， and the eluent volume is 3 BV， the desorption rate is as high as 95.7%. The ·OH and DPPH· scavenging rates of blueberry anthocyanins purified with mixed resins are higher than those before purification. The scavenging rates of anthocyanins on ·OH before and after purification are 96.25% and 97.85% respectively. The scavenging rates of anthocyanins on DPPH· before and after purification are 88.35% and 93.20% respectively. The mixed resins of D101 and HP-20 have good purification effects on blueberry anthocyanins and can be used for the purification of blueberry anthocyanins. After purification， the antioxidant capacity of blueberry anthocyanins is significantly improved， which can better scavenge ·OH and DPPH·， and the scavenging effect on ·OH is higher than that on DPPH·.

Key words： mixed resins; blueberry anthocyanins; separation and purification; antioxidant activity

蓝莓（Vaccinium spp.）属杜鹃花科越橘属，学名越橘，又称蓝浆果。蓝莓花青素是蓝莓果中最重要的生物活性成分，属于以2-苯基苯并吡喃为母核的黄酮类化合物。蓝莓花青素是一种植物水溶性天然色素，平均含量可达到5.378 mg/g。花青素被赋予“口服的皮肤化妆品”之称，是迄今发现的最有效的天然抗氧化活性成分，除抗氧化特性外，还具有缓解视疲劳、抗癌细胞增殖、改善心血管疾病、调节糖尿病、保肝护肾、改善肠道微生物群、提高人体免疫机能等多种功效。因此，花青素在食品、医疗、化妆品等领域开发前景良好。

目前分离纯化蓝莓花青素的大孔树脂有AB-8型、D3520型、FPX66型，分离纯化其他色素的大孔树脂有D101型、HP-20型、NKA-9型，将大孔树脂混合后分离纯化蓝莓花青素的研究鲜有报道。本课题组前期研究发现，超声波辅助柠檬酸提取解冻后蓝莓花青素效果较好。已有其他解冻后浆果花青素提取的研究，蓝莓花青素的提取会影响到后续大孔树脂的分离纯化。已有研究中对AB-8型树脂分离纯化蓝莓花青素的研究相对较多。AB-8型树脂静态吸附率在87.65%～97.73%，动态解吸率在82.00%～84.80%。与AB-8型树脂解吸比较，D3520型、FPX66型树脂所需解吸乙醇浓度稍高，吸附和解吸时间也稍长一些。分离其他色素和黄酮类物质的 D101型树脂所需解吸乙醇浓度在70%～80%，解吸流速与其他树脂基本一致。大孔吸附树脂用于分离纯化具有稳定的理化性质，因其具备洗脱后可反复使用、成本低、污染小、含量多、效率高等优点，广泛应用于色素的分离纯化。

本研究以蓝莓花青素粗提物作为纯化对象，在D101型、HP-20型、AB-8型、NKA-9型、D3520型5种树脂中，通过静态吸附试验筛选最适宜用于纯化蓝莓花青素的大孔树脂，研究混合大孔树脂协同对蓝莓花青素的吸附和解吸条件，并比较分离纯化前后花青素的抗氧化特性，为蓝莓花青素的分离纯化提供了参考。

1" 材料与方法

1.1" 材料与试剂

蓝莓：市售，产地为辽宁省庄河市。

焦性没食子酸（分析纯）：湖南化工研究院科兴化工试剂厂；磷酸氢二钠、水杨酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸（分析纯）：天津市化工三厂有限公司；D101型大孔树脂：国药集团化学试剂有限公司；AB-8型大孔树脂、硫酸亚铁（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；HP-20型大孔树脂、NKA-9型大孔树脂、D3520型大孔树脂：郑州和成新材料科技有限公司；30%过氧化氢（分析纯）：广州检测科技有限公司；2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH，纯度96%）：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2" 仪器与设备

FA1104型电子天平（精度0.1 mg）" 上海良平仪器仪表有限公司；2200TH型数控加热式超声波清洗器" 上海安谱实验科技股份有限公司；DZKW-12-2 型数显电热恒温水浴锅" 北京市永光明医疗仪器有限公司；T6型紫外可见分光光度计" 北京普析通用仪器有限责任公司；SHZ-DⅢ型台式循环水式真空泵" 巩义市予华仪器有限责任公司；80-2 型电动离心机" 常州市金南仪器制造有限公司；BCD-190TMPK海尔冰箱" 海尔智家股份有限公司。

1.3" 蓝莓花青素的提取

准确称取10.00 g冷冻市售蓝莓，在超声频率40 kHz、超声温度20 ℃的条件下超声解冻10 min，按固液比1∶2.5（g/mL）加入15%柠檬酸进行研磨后，在恒温50 ℃水浴浸提1 h，以4 000 r/min离心10 min，上清液即为蓝莓花青素粗提液。蓝莓花青素粗提液和花青素标准品分别在400～800 nm处扫描，得最大吸收波长均在520 nm处，以下测定均在该波长下进行。

1.4" 标准曲线的制作

精确称量4.000 g焦性没食子酸，充分溶解于pH 3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，室温下稀释至50 mL，摇匀，得到蓝莓花青素标准溶液，浓度80 mg/mL。制备一系列浓度分别为8，16，24，32，40 mg/mL的标准溶液，测定其在520 nm波长处的吸光度值。以浓度X（mg/mL）为横坐标，吸光度值Y为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数：

Y=0.013 3X+0.018 5（R2=0.997 4）。（1）

1.5" 大孔树脂的预处理

在无水乙醇溶液中分别浸泡5种大孔树脂D101型、AB-8型、HP-20型、NKA-9型、D3520型24 h，使之充分溶胀。将已溶胀的树脂湿法装柱，用蒸馏水冲洗至流出液澄清、无白浊、无酒精味；然后将洗净的树脂在4% HCl溶液中浸泡4 h，并用蒸馏水反复冲洗至中性；再加入50 g/L的NaOH溶液并浸泡4 h，用蒸馏水反复冲洗至中性，待用。

1.6" 大孔树脂的筛选

准确称取预处理好的5种大孔树脂各2.00 g，向其中加入20 mL蓝莓花青素粗提液，于超声温度30 ℃、超声频率40 kHz的条件下振荡吸附40 min，树脂吸附饱和后取出，吸取一定量上层样液测定花青素吸附后的浓度，并参考夏锦锦等的方法并稍作修改，吸附率的计算见公式（2）：

吸附率E1（%）=C0×V0×f0-C1×V1×f1C0×V0×f0×100%。（2）

式中：C0、C1分别为吸附前样液浓度（mg/mL）、吸附后样液浓度（mg/mL）；V0、V1分别为吸附前样液体积（mL）、吸附后样液体积（mL）；f0、f1 分别为吸附前稀释倍数、吸附后稀释倍数。

1.7" 大孔树脂混合比例的确定

固定混合树脂质量2.00 g，将树脂按2∶0、1.8∶0.2、1.2∶0.8、1∶1、0.8∶1.2、1.2∶0.8、0∶2的比例均匀混合，根据1.6 进行吸附试验，分别计算不同混合比例的树脂对蓝莓花青素的吸附率。

1.8" 吸附比例的确定

准确称取预处理好的大孔树脂2.00 g，分别按1∶1、1∶3、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的比例向其中加入2，6，10，20，30，40，50 mL 蓝莓花青素粗提液，根据1.6 进行吸附试验，分别计算不同吸附比例对蓝莓花青素的吸附率。

1.9" 混合树脂静态吸附条件研究

对混合树脂纯化蓝莓花青素静态吸附条件进行研究，考察单因素蓝莓粗提液浓度（20%、40%、60%、80%、原样液（100%））、超声频率（0，40，50，60，70，80 kHz）、吸附时间（20，30，40，50，60 min）、吸附温度（10，20，30，40，50 ℃）对吸附率的影响。

1.10" 混合树脂动态解吸条件研究

对混合树脂纯化蓝莓花青素动态解吸条件进行研究，将混合树脂湿法装柱（直径 2.0 cm，柱高 30 cm），确保无气泡后动态上样，考察上样流速（0.625，1.000，1.250 mL/min）、上样体积（2，5，8 mL）、上样浓度（60%、80%、原样液（100%））、洗脱剂乙醇浓度（50%、60%、70%）对解吸率的影响，确定最大洗脱体积。每5 mL收集一管解吸液，测定解吸后花青素浓度，参考夏锦锦等的方法并稍作修改，解吸率的计算见公式（3）：

解吸率E2（%）=C2×V2×f2C0×V0×f0×100%。（3）

式中：C0、C2分别为吸附前样液浓度（mg/mL）、解吸后样液浓度（mg/mL）；V0、V2分别为吸附前样液体积（mL）、解吸后样液体积（mL）；f0、f2分别为吸附前稀释倍数、解吸后稀释倍数。

1.11" 蓝莓花青素抗氧化能力测定

1.11.1" 羟基自由基（·OH）清除率测定

依次取6 mmol/L FeSO4溶液1 mL、6 mmol/L水杨酸乙醇溶液1 mL加入试管中，分别再取15，20，25，30，35 μL纯化前后的蓝莓花青素粗提液，在试管中充分混匀后，加入1 mL 5 mmol/L H2O2溶液并启动反应，在37 ℃恒温水浴中反应30 min，测定其在510 nm波长处的吸光度值A，设乙醇作为空白对照，重复相同试验3次，计算纯化前后蓝莓花青素对·OH的清除率，见公式（4）：

·OH清除率（%）=（1-AX-AX0A0）×100%。（4）

式中：AX为样液的吸光度值；AX0为不加H2O2时样液的吸光度值；A0为对照溶液的吸光度值。

1.11.2" 2，2-二苯基-1-苦基肼自由基（DPPH·）清除率测定

分别取20，25，30，35，40 μL纯化前后蓝莓花青素粗提液放入试管中，加入2 mL 0.1 mmol DPPH溶液，充分混匀，并在避光处反应30 min，测定517 nm波长处的吸光度值A，重复相同试验3次，计算纯化前后蓝莓花青素对DPPH·的清除率，见公式（5）：

DPPH·清除率（%）=（1-A1-A2A0）×100%。（5）

式中：A1为样液的吸光度值；A2为无水乙醇代替DPPH·溶液的吸光度值；A0为对照试验（水代替花青素溶液）的吸光度值。

2" 结果与分析

2.1" 树脂的确定

注：不同小写字母表示有显著性差异（Plt;0.05），下图同。

由图1可知，5种树脂对蓝莓花青素粗提液的吸附效果为D101gt;HP-20gt;AB-8gt;NKA-9gt;D3520，其中D101型树脂的吸附效果最佳，显著高于AB-8、D3520、NKA-9（Plt;0.05），但与HP-20 相比差异不大（Pgt;0.05）。这可能是因为蓝莓花青素中甲氧基含量过多而使其有一定非极性，根据大孔树脂的吸附特性，非极性、弱极性树脂对其具有较好的吸附效果，而这5种树脂中，D101型、HP-20型树脂作为非极性树脂，对蓝莓花青素的吸附率较其他几种高，适用于蓝莓花青素的纯化，这与杜月娇等的研究结果一致。 因此，选择D101型、HP-20型两种树脂混合分离纯化蓝莓花青素。

2.2" 混合树脂比例的确定

由图2可知，固定混合树脂总质量为2.00 g，将D101型、HP-20型两种树脂按不同质量比例混合后，对蓝莓花青素静态吸附的顺序为1.8∶0.2gt;0.8∶1.2gt;1.2∶0.8gt;0.2∶1.8gt;1.0∶1.0gt;2.0∶0gt;0∶2.0，混合树脂的吸附效果均好于单一D101型树脂、HP-20型树脂，有显著性差异（Plt;0.05）。当D101∶HP-20为1.8∶0.2时吸附率最高，最适合于蓝莓花青素的分离纯化。

2.3" 吸附比的确定

由图3可知，吸附比例对吸附率的影响较大，当吸附比例为1∶1时，蓝莓花青素的吸附率最高，且超过90%，与其他吸附比例差异显著（Plt;0.05），这可能是由于吸附比例升高，树脂吸附饱和，导致吸附率不断下降。为避免蓝莓花青素粗提液浪费，选择吸附比例为1∶1进行吸附。

2.4" 混合树脂静态吸附条件的确定

2.4.1" 样液浓度的确定

由图4可知，混合树脂的吸附率随着蓝莓粗提液浓度的升高呈现先上升后下降的趋势，当样液浓度为80%时，蓝莓花青素的吸附率最高。当蓝莓花青素粗提液浓度高于80%时，少量杂质会造成大孔树脂表面堵塞，花青素的吸附率呈现下降趋势，但影响不大。因此，选择样液浓度80%比较适宜。

2.4.2" 超声频率的确定

由图5可知，随着超声频率的增加，混合树脂的吸附率先上升后下降，当超声频率达到40 kHz时，混合树脂的吸附效果最佳，吸附率最高，为97.4%，一定频率的振动会加快色素的吸附。但超声频率过大会干扰树脂的吸附作用，花青素吸附不牢固，吸附效果下降，这与Wu等的研究结果相似。

2.4.3" 吸附时间的确定

由图6可知，随着吸附时间的增加，混合树脂的吸附率先上升后下降，当超声时间为40 min时，混合树脂的吸附效果最佳，吸附率超过95%，考虑到40 min后吸附率无显著性差异（Pgt;0.05）以及能耗等原因，选择40 min为最佳吸附时间。

2.4.4" 吸附温度的确定

由图7可知，随着吸附温度的增加，吸附率呈先上升后逐渐下降的趋势，在一定温度范围内，温度升高会加快树脂的吸附作用，吸附效果随着温度的上升而增加，但是当温度高于某一临界值时，高温会破坏花青素的结构，干扰树脂的吸附作用，吸附率下降，这与许志新等的研究结果一致，当温度为30 ℃时，吸附率最高，为96.1%，因此，最佳吸附温度为30 ℃。

2.4.5" 静态吸附正交试验

根据2.4单因素试验结果，选取A超声频率（kHz）、B吸附温度（℃）、C吸附时间（min）、D吸附浓度（%）4个因素设计正交试验L9（34），因素水平表见表1。

正交试验9组试验组合及其吸附率结果见表2。

由表2极差分析结果可知，混合树脂静态吸附蓝莓花青素的影响因素主次顺序为A（超声频率）gt;D（吸附浓度）gt;C（吸附时间）gt;B（吸附温度），混合大孔树脂静态吸附蓝莓花青素的最佳条件为A2B1C2D3。

对表2中结果进行显著性分析，具体数据见表3。

由表3方差分析可知，对树脂吸附率的影响顺序是超声频率gt;吸附浓度gt;吸附时间gt;吸附温度，与极差分析结果一致，其中超声频率和吸附浓度的影响极显著，其他因素的影响不显著。

验证正交试验最优组合A2B1C2D3与单因素试验最优组合A2B2C2D2，A2B1C2D3的吸附率分别为95.4%、97.3%和95.9%，平均吸附率为96.2%，A2B2C2D2的吸附率分别为95.2%、94.1%和94.8%，平均吸附率为94.7%。最终确定静态吸附最优组合为A2B1C2D3，即当超声频率为40 kHz、吸附温度20 ℃、吸附时间40 min、吸附浓度为原样液时，树脂的吸附效果最佳。

2.5" 混合树脂动态解吸条件确定

2.5.1" 洗脱速度的确定

由图8可知，随着洗脱流速的增大，混合树脂对蓝莓花青素的动态解吸率先上升后下降。在较慢的流速下，解吸液与花青素能够更加充分地接触、解吸，解吸率高，反之，流速升高，解吸液中的花青素尚未被吸附就被洗脱，解吸率下降。当流速为 1.000 mL/min 时，解吸效果最佳，这与栾浩等的研究结果一致，因此，选择1.000 mL/min 为最佳洗脱流速。

2.5.2" 上样量的确定

由图9可知，随着解吸时间的延长，解吸率先上升后逐渐下降，洗脱峰出现在13～15管之间，此时洗脱体积在65～75 mL之间。上样量8 mL的动态总解吸率最大，考虑到从出现峰值到最高峰的时间段内，上样量为5 mL时解吸率最大，解吸效果最佳。因此，选择最佳上样量为5 mL。

2.5.3" 洗脱剂乙醇浓度的确定

由图10可知，混合树脂对蓝莓花青素提取液的解吸率随着乙醇浓度的增大先上升后下降，洗脱峰出现在13～16管之间，此时洗脱体积在65～80 mL之间。乙醇浓度为60%时解吸率最高（77.7%）。当乙醇浓度低于60%时，混合树脂中的花青素不能被完全洗脱出来；当乙醇浓度高于60%时，导致更多杂质被洗脱下来，影响花青素的纯度，且造成乙醇的浪费，这与Xue等和段筱杉等的研究结果一致。因此，选择乙醇浓度为60%。

2.5.4" 上样液浓度的确定

由图11可知，随着洗脱时间的延长，解吸率先上升后下降，洗脱峰出现在14～15管之间，洗脱体积在60～75 mL之间。80%和原样液浓度的解吸率相差不大，样液从出现峰值到最高峰的时间段内，两者解吸率接近，原样液浓度的解吸率最大。因此，选择原样液浓度进行解吸。

2.6" 蓝莓花青素抗氧化能力测定

2.6.1" 羟基自由基（·OH）清除率测定

由图12可知，与纯化前的蓝莓花青素相比，纯化后的蓝莓花青素对·OH的清除能力较强，当花青素溶液体积在15～35 μL范围内，清除能力逐渐增强，这与Hu等的研究结果一致；当花青素溶液体积较小时，纯化前后的蓝莓花青素对·OH 的清除能力相差较大，随着花青素溶液体积增加，两者的清除能力逐渐接近。但是纯化后的蓝莓花青素对·OH的清除能力显著增强，最大清除率可达到97.85%。

2.6.2" DPPH自由基（DPPH·）清除率测定

由图13可知，蓝莓花青素溶液体积与DPPH·清除率存在剂量-效应关系，当花青素溶液体积在20～40 μL范围内，DPPH·清除率与花青素溶液体积呈正相关性。纯化后的蓝莓花青素对DPPH·的清除能力显著增加，最大清除率可达93.20%。

3" 结论

近年来研究发现大孔树脂在分离纯化天然色素方面效果突出，本研究着重于筛选吸附、解吸效果较好的大孔树脂混合协同分离纯化蓝莓花青素，提高其产品附加值。研究结果表明，AB-8型、D101型、HP-20型、 NKA-9型、D3520型5种树脂中，D101型、HP-20型两种树脂按质量比9∶1混合吸附效果较单一，D101型、HP-20型树脂吸附效果好。静态吸附、动态解吸研究表明，低超声频率与室温更有利于保护花青素的稳定性，吸附达到平衡的时间至少为40 min。静态吸附率、动态解吸率分别达到96.2%、95.7%，说明混合大孔树脂适合于蓝莓花青素的分离纯化。抗氧化性研究结果表明，蓝莓花青素的抗氧化能力很强，抵抗·OH 和DPPH·明显，花青素浓度越高，对自由基的清除率越高，且蓝莓花青素对·OH的清除率高于DPPH·。目前混合大孔树脂对蓝莓花青素的分离纯化研究较少，本研究纯化蓝莓花青素的工艺简单，可以为蓝莓花青素的工业化生产提供基础技术支撑。目前仅对蓝莓花青素进行了分离纯化和部分抗氧化性研究，今后可对蓝莓花青素结构、理化性质、其他生理活性如体外消化特性及体内代谢规律进行研究，以拓宽其在食品、医药、保健品领域的应用。

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