不同乳粉中优势芽孢杆菌的检测与分析

摘要：为研究乳粉中菌落总数和芽孢杆菌种属的组成，分析乳粉在运输、销售、贮藏过程中的风险菌，该研究以国内某品牌的6种不同产地的乳粉为研究对象，采用传统的平板培养方法结合非热处理和热处理两种处理方式对6种乳粉中菌落总数、芽孢菌数量进行统计分析，并通过形态学、革兰氏染色镜检结合16S rDNA鉴定样品中的优势芽孢杆菌。6种样品中的菌落总数主要在102～103 CFU/g范围内，均小于国家标准5.0×104 CFU/g，符合GB 19644—2010的安全范围。芽孢杆菌在6种样品中均有检出，检出值在101～102 CFU/g范围内。根据形态学观察分类得到7种革兰氏阳性芽孢杆菌，经16S rDNA和BLAST比对鉴定，芽孢杆菌分别为Bacillus licheniformis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus circulans、Bacillus paramycoides、Bacillus subtilis、Bacillus velezensis和Bacillus cereus。不同乳粉的菌落总数符合国家标准要求范围，但其中芽孢杆菌种类繁多，是乳粉中微生物的主要优势菌。该研究为我国乳粉质量的监督与监测提供了数据支撑，为乳粉的安全风险评估提供了科学依据。

关键词：乳粉；细菌总数；芽孢杆菌；16S rDNA；分离鉴定

中图分类号：TS201.3""""" 文献标志码：A""""" 文章编号：1000-9973（2024）08-0007-05

Detection and Analysis of Dominant Bacillus in Different Milk Powder

XU Li-na1， LIU Shi-jie1， ZHU Yao-di1，2， ZHAO Li-jun1， LIANG Dong1，2，

ZHAO Gai-ming1， LI Miao-yun1*

（1.College of Food Science and Technology， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China;

2.Postdoctoral Innovation Base of Henan Jiuyuquan Food Co.， Ltd.， Xinxiang 453500， China）

Abstract： To study the total bacterial count and the composition of Bacillus species in milk powder and analyze the risk bacteria during the transportation， sales and storage of milk powder， in this study， with six kinds of milk powder from different places of origin of a domestic brand as the research object， the total bacterial count and the number of Bacillus in six kinds of milk powder are statistically analyzed by traditional plate culture method combined with non-heat treatment and heat treatment， and the dominant Bacillus in the samples is identified by morphology， Gram staining microscopy combined with 16S rDNA. The total bacterial count in the six samples is mainly in the range of 102～103 CFU/g， which is all less than the national standard of 5.0×104 CFU/g， and meets the safety range of GB 19644—2010. Bacillus is detected in all the six samples， with the detection value in the range of 101～102 CFU/g. According to morphological observation， seven kinds of Gram-positive Bacillus are classified. After 16S rDNA and BLAST comparison， Bacillus is identified as Bacillus licheniformis， Bacillus amyloliquefaciens， Bacillus circulans， Bacillus paramycoides， Bacillus subtilis， Bacillus velezensis and Bacillus cereus respectively. The total bacterial count of different milk powder meets the requirements of national standards， but there are many kinds of Bacillus， which are the main dominant bacteria in milk powder. This study has

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.08.002

引文格式：徐丽娜，刘世杰，朱瑶迪，等.不同乳粉中优势芽孢杆菌的检测与分析.中国调味品，2024，49（8）：7-11.

XU L N， LIU S J， ZHU Y D， et al.Detection and analysis of dominant Bacillus in different milk powder.China Condiment，2024，49（8）：7-11.

收稿日期：2024-01-15

基金项目：河南省重大科技专项（221100110500）；河南省杰出青年项目（212300410008）；河南省高等学校重点科研项目（22A550013）；河南省高校科技创新团队支持计划（22IRTSTHN021）；河南省科技攻关项目（232102110136）；河南省重点研发项目（22A550009）

作者简介：徐丽娜（1979—），女，讲师，硕士，研究方向：食品加工与质量控制。

*通信作者：李苗云（1976—），女，教授，博士，研究方向：食品加工与质量控制。

provided data support for supervision and monitoring of milk powder quality in China and scientific basis for safety risk assessment of milk powder.

Key words： milk powder; total bacterial count; Bacillus; 16S rDNA; separation and identification

乳粉是一种以新鲜牛奶或羊奶为原料，经过浓缩处理后用低温或热处理的方法开发的高营养产品，极易受微生物污染，尤其是芽孢杆菌，是极大的安全隐患。近年来随着经济的发展，人们对美好生活的需求日益增长，消费者对乳粉类健康、营养丰富的食品的消费量大幅度增加。随着人们消费水平和生活水平的提高，乳粉不再仅仅是婴幼儿和老年人群体必不可少的营养食品，在调味品行业中的使用也日益增加。根据餐饮业对标准便捷化的需求、家庭消费对方便味美营养的需求，复合调味品产品越来越趋向功能化，市场需求不断增长。其中，乳粉是复合调味粉（如鸭汤调味粉、火锅调味粉等）的主要原料之一，可在提高复合调味粉风味和口感的同时增加产品的营养价值。因此，乳粉的安全性是非常重要的。

芽孢杆菌是乳粉中常见的污染菌，每年由于食源性致病菌导致的食源性疾病造成全球约2 000万人死亡，对食品质量安全存在极大的威胁，是产品变质的主要潜在危害。芽孢是芽孢杆菌在极端条件下形成的休眠体，抗逆性极强，一旦萌发即可产毒，不仅给企业造成极大的损失，而且给人体健康造成极大危害。其主要原因有两个方面：一方面，生产乳粉的原料牛奶从农场到车间生产的过程中由于养殖环境自然化、生产加工以及包装运输过程复杂，非常容易引入芽孢杆菌；另一方面，芽孢的抗逆性强，其在经过巴氏杀菌和干燥等处理的过程中可以存活下来，并在乳粉中继续以细菌休眠体的形式存在，一旦条件适宜便萌发形成菌落并快速繁殖，产生大量的蛋白酶、脂肪酶等各种酶类，降低食品的感官品质与营养价值，造成产品的腐败变质甚至危害消费者的健康。2011年，孟浩浩等对牛乳进行超高温灭菌处理前、后的微生物情况进行分析，得到牛乳中存在芽孢杆菌且通过超高温灭菌方式难以杀死的结论。近年来，随着乳粉现代化、工业化加工设备的进步和生产技术的革新，鲜见对乳粉中优势芽孢杆菌鉴定和分析的及时有效的相关报道。

基于此，本研究以国内某品牌的6种不同产地的乳粉为研究对象，采用传统的平板培养方法结合非热处理和热处理两种处理方式对6种乳粉中菌落总数和芽孢数进行统计分析，进一步通过形态学观察和分子生物学（16S rDNA）方法进行种属鉴定，确定6种不同产地乳粉中的优势芽孢杆菌类别，更加全面地了解乳粉中潜在优势芽孢杆菌的种属类别，以期对乳粉的质量检测和复合调味粉的安全控制提供指导，保障复合调味粉在生产和运输过程中的安全性并为消费者的健康提供保障。

1" 材料与方法

1.1" 材料与试剂

6种不同产地的乳粉由国内某品牌食品公司提供，将6种样品分别编号为样品1～6。

大豆酪蛋白琼脂（soybean-casein digest agar，TSA）培养基、营养琼脂（nutrient agar，NA）培养基、革兰氏染色试剂盒：青岛高科园海博生物技术有限公司；PCR检测试剂盒、离心柱型细菌DNA提取试剂盒：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2" 仪器与设备

HIRAYAMA HVE-50高压灭菌器" 华粤行仪器有限公司；BIOBASE生物安全柜" 济南鑫贝西生物技术有限公司；Allegra-64R高速冷冻离心机" 美国Beckman Coutter公司；Nikon ECLIPSE 80i科研级显微镜" 日本尼康公司；AL104电子分析天平（测量精度为0.1 mg）" 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Biometra T-Gradient梯度PCR仪" 德国Biometra公司；IKA Vortex Geniu旋涡混匀仪" 北京佳源兴业科技有限公司；MIR-254低温培养箱" 日本Sanyo公司。

1.3" 微生物的分离培养与纯化

参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中的方法进行菌落总数的培养。

芽孢杆菌的分离培养与纯化：在无菌条件下将6种样品各取25 g于225 mL无菌生理盐水中，于均质机中拍打2 min制备菌悬液，然后将上述菌悬液经80 ℃水浴热处理10 min，冷却至室温后进行芽孢杆菌的分离培养，在无菌条件下准确吸取不同浓度梯度的菌悬液0.2 mL，分别涂布于TSA培养基表面，于37 ℃培养24～48 h后计数，同时用灭菌生理盐水作空白对照。进一步将TSA培养基上菌落形态不同的典型菌株分别采取“三区划线”方式纯化3代，保存菌株备用。

1.4" 优势芽孢杆菌的种属鉴定

1.4.1" 优势芽孢杆菌的菌落形态及镜检

观察记录热激处理组分离纯化的菌落形状、边缘、光滑度、透明度和颜色等，并通过计数对未知优势芽孢杆菌进行初步判断和分类，使用革兰氏染色法对分离纯化后的菌株进行微生物镜检，并判别微生物是革兰氏阳性菌还是阴性菌。通过观察分离到的微生物在平板上的菌落形态与在显微镜下观察到的个体形态，参考《常见细菌系统鉴定手册》对其进行初步判定。

1.4.2" 16S rRNA基因序列分析和系统发育树的构建

采用细菌通用引物27F：AGAGTTTGATCMTGG-CTCAG；1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT，对三代纯化后的未知优势芽孢杆菌的16S rDNA进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖电泳分离。PCR产物送至生工生物工程（上海）有限公司测序，得到的16S rDNA序列在NCBI-GenBank进行BLAST同源性检测分析，找到序列最相近的微生物种类。采用Mega 7.0软件，用邻接法构建系统发育树，通过自举分析进行置信度检测，自举数集1 000次，相似度达96%以上认为是同一种菌。

2" 结果与分析

2.1" 乳粉中的菌落总数和芽孢数分布情况

按1.3中的方法对6种不同产地乳粉中的菌落总数和芽孢杆菌数量的分布情况进行统计，结果见表1。

由表1可知，6种样品中的菌落总数主要在102～103 CFU/g范围内，均小于国家标准5.0×104 CFU/g，符合GB 19644—2010《食品安全国家标准 乳粉》的安全范围。经检测，6种样品中均含有芽孢菌，芽孢菌数量主要在101～102 CFU/g范围内，普遍存在于不同的乳粉样品中，且芽孢的存在对乳粉在生产流通过程中的营养品质和消费者的健康安全存在潜在危害。因此，进一步对芽孢杆菌进行纯化鉴定，可以为乳粉的质量监督与检测提供指导意义。

2.2" 芽孢杆菌菌落形态及镜检结果

对热激处理组的TSA培养基上微生物的菌落形态进行分类，共得到7种不同形态的优势芽孢杆菌，分别编号 W1～W7，并进行菌落形态特征记录和革兰氏染色镜检。7种不同形态的优势芽孢杆菌在TSA培养基上的形状大小、光泽度、黏稠度等特征见表2，7种不同形态的优势芽孢杆菌在TSA培养基上纯化的菌落形态及革兰氏染色镜检图见图1。

由表2可知，7种不同形态的优势芽孢杆菌均为革兰氏阳性杆菌。

2.3" 16S rRNA基因序列分析和系统发育树的构建

提取7种待测菌株W1～W7 的DNA片段进行PCR扩增，将扩增得到的DNA片段进行核酸凝胶电泳30 min，7种待测菌株16S rDNA片段PCR扩增产物凝胶电泳图见图2。

由图2可知，7种菌株均在1 500 bp处出现单一荧光条带，产物条带清晰，符合测序需要。

对7种待测优势菌株进行16S rDNA测序后，将序列结果录入NCBI数据库进行BLAST同源性检索分析，结果见表3。

分别将7株优势菌株的16S rDNA序列与GenBank上5株同源性较高的菌株序列进行对比，利用Mega 7.0软件构建系统发育树，见图3。

由表3和图3可知，W1号菌株的16S rDNA序列与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）同源性最高，匹配度为99.17%，并且在图3的系统发育树中W1和Bacillus licheniformis位置最近，亲缘关系较近，因此，W1被鉴定为Bacillus licheniformis。同理，根据16S rDNA序列同源性对比和系统发育树的构建，可以得到：W2号菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），W3号菌为环状芽孢杆菌（Niallia circulans），W4号菌为副蕈样芽孢杆菌（Bacillus paramycoides），W5号菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），W6号菌为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），W7号菌为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。其中，地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌与王伟军等在2015年从原料乳粉中分离到的芽孢杆菌种属一致；2016年，闫琳等对中国10个省市售的乳粉进行食源性致病菌污染水平调查的结果显示，蜡样芽孢杆菌是乳粉中主要的致病菌。不同配方、不同产地的乳粉中芽孢杆菌污染虽然存在不同程度上的差异，但是芽孢杆菌在乳粉中均有检出，应当在运输、销售、贮藏过程中做好微生物防控措施，避免优势芽孢杆菌的繁殖增长，保障消费者的健康和安全。

3" 结论

本研究以国内某品牌的6种不同产地的乳粉为研究对象，采用传统的平板培养方法结合非热处理和热处理两种处理方式对6种乳粉中菌落总数和芽孢数进行统计分析，进一步通过形态学观察和分子生物学（16S rDNA）方法进行种属鉴定，确定6种不同产地乳粉中的优势芽孢杆菌类别及污染情况。结果显示，6种样品中的菌落总数主要在102～103 CFU/g范围内，均小于国家标准5.0×104 CFU/g，符合GB 19644—2010《食品安全国家标准 乳粉》的安全范围。芽孢杆菌在6种样品中均有检出，检出值在101～102 CFU/g范围内。进一步，通过微生物分离纯化得到7种典型菌落形态的优势芽孢杆菌，通过16S rDNA和BLAST比对鉴定可知，优势芽孢杆菌分别为Bacillus licheniformis、Bacillus amyloliquefaciens、Niallia circulans、Bacillus paramycoides、Bacillus subtilis、Bacillus velezensis和Bacillus cereus。通过检测乳粉的菌落总数和芽孢菌数量及种属分布，为我国乳粉和复合调味粉的安全质量监督与风险评估、企业产品质量提升提供了一定数据支撑和科学依据，并为标准的制定提供了有力参考。

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