滇东北地区杉木叶斑病病原菌的分离与鉴定

摘要：运用形态学及ITS测序方法，对滇东北地区发现的杉木（Cunninghamia lanceolata）叶斑病病原菌进行鉴定。结果表明，该叶斑病的病原菌形态学特征和分子鉴定结果与Phragmocamarosporium platani相似，初步鉴定为Phragmocamarosporium platani近似种Phragmocamarosporium aff. platani。本研究是该病原菌对杉木危害的初次报道。

关键词：杉木（Cunninghamia lanceolata）；叶斑病；Phragmocamarosporium；滇东北地区

中图分类号：S436.8" " " " "文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）12-0057-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.12.010 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation and identification of the pathogen causing leaf spot on Cunninghamia lanceolata in northeast Yunnan

LIU Ping1， LING Xiao-fei2， YAN Qing-hua1， ZHU Hui-qin1， HU Xing-yong3， TIAN Mao-xun3

（1. Yunnan Forestry Technological College， Kunming" 650224， China； 2. Institute of Highland Forest Science， Chinese Academy of Forestry，Kunming" 650224， China；3. Forestry and Grassland Bureau of Yongshan， Yongshan" 657300， Yunnan， China）

Abstract： The pathogen of Cunninghamia lanceolata leaf spot was identified through morphology and ITS sequencing analysis. The results showed that the morphological characteristics and molecular identification of the leaf spot pathogen were similar to Phragmocamarosporium platani， and it was preliminarily identified as Phragmocamarosporium aff. platani. This study was the first report of the Phragmocamarosporium causing damage to Cunninghamia lanceolata.

Key words： Cunninghamia lanceolata； leaf spot； Phragmocamarosporium； northeast Yunnan

收稿日期：2023-12-12

基金项目：云南省教育厅科学研究基金项目（2022J1385）；云南林业职业技术学院科技创新团队项目（KY（TD）202302）

作者简介：刘 平（1982-），女，云南盐津人，副教授，博士，主要从事昆虫生态学及植物病虫害防控研究，（电话）15887837410（电子信箱）liuping0101@aliyun.com；通信作者，胡兴永（1976-），男，云南永善人，高级工程师，主要从事森林防灭火工作，（电话）13578064202（电子信箱）948971220@qq.com。

昭通市永善县国有林场位于云南省东北部向四川盆地倾斜的坡面上，其气候类型为大陆性季风气候，由于季风的强弱交替和迟早不同，导致雨热同期、干冷同季的特点。林场地处亚热带，境内地势崎岖，地形地貌复杂，海拔高差较大，属于“一山分四季，十里不同天”的特殊气候类型。林场森林植被介于中国亚热带东部湿润常绿阔叶林与西部半湿润常绿阔叶林的过渡地带，因此动植物种类繁多。永善县国有林场和自然保护区是永善县最为宝贵的森林资源，是全县最重要的生态安全屏障和森林资源基地，是金沙江下游生态保护修复工程的核心保护区域，同时也是维系永善县人民生命之源的中央水塔。

杉木［Cunninghamia lanceolata （Lamb.） Hook］又名沙木、沙树，隶属于杉科（Taxodiaceae）杉木属，因其良好的适应能力、生长速度以及抗逆能力等特性，是中国南方各省重要的用材树种和生态树种［1］。杉木凭借其优良的木质品质广泛用于造纸、家具制作等，因需求量增大，大量的杉木人工林出现，影响其品质的病虫害也引起人们的广泛关注。相比于虫害，病害对杉木的威胁更大，也常因病害的发生造成巨大的经济损失。细菌、线虫、缺素症等引起的杉木病害研究相对较少［2-10］，而由真菌引起的杉木病害较多，如杉木炭疽病［11］、溃疡病［12-14］、赤枯病［15，16］、梢枯病［17-20 ］、叶枯病［16，21］、顶枯病［22，23］、枯萎病［24］及球果坏死［12］等。从杉木病害病原菌分类方面来看，寄生于杉木的大多是半知菌，而少部分是子囊菌。

杉木是永善县国有林场公益林的主要树种。近年来，永善县国有林场杉木陆续出现枯梢、植株零星甚至连片枯死现象，经过走访调查，发现杉木叶片上出现一些大小不等的病斑。发病严重时，病斑间相互连接扩展到整个杉木叶片，更有甚者叶片枯死。为明确永善县国有林场杉木叶斑病的病因，本研究对该病病原菌进行分离，结合形态学和分子生物学手段对病原菌进行鉴定，以期为永善县国有林场杉木叶斑病病原菌的诊断和该病害的综合防控提供理论基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材 2020—2022年的6—12月，在云南省昭通市永善县国有林场莲峰镇林场工作站附近采集具有典型病斑杉木叶片样本（103°36′42.75″E，27°51′32.98″N，海拔2 217.10 m）。将采集的杉木叶片样本放入采样箱中低温保存，以便将其运回实验室，备用。

1.1.2 试剂 Biospin真菌基因组DNA抽提试剂盒，BioFlux；常规PCR MIX试剂、DNA分子质量标准Marker（100～5 000 bp），生工生物工程（上海）股份有限公司；2%水琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基，广东环凯微生物科技有限公司。其中，马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基配方：马铃薯300 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、氯霉素0.1 g、1 000 mL去离子水。

1.1.3 仪器 PCR仪（SimpliAmp TM型），美国应用生物系统公司（美国ABI）；光学显微镜（ECLIPSE 80i型），尼康株式会社（Nikon corporation）；体式显微镜（SZ61型），奥林巴斯（Olympus corporation）；恒温培养箱（CB160型），德国宾得（Binder），高压蒸汽灭菌器（LS-3750型），三洋（SANYO）；超净工作台（SW-CJ-1FD型），苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；电子天平（PL2002型），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 形态学观察 在体式显微镜或光学显微镜下观察产孢体和分生孢子形态特征，对典型、清晰的特征拍照，测量分生孢子大小，共测量30个孢子。

1.2.2 单孢分离法 采用单孢分离法获得培养物。取1个产孢体，用乙醇表面消毒1 min，再用无菌水漂洗，重复1次。后将产孢体内的分生孢子与无菌水制成孢子混合液，并将混合液均匀涂布在2%水琼脂平板上。25 ℃黑暗培养，36～48 h后取出平板置于体式显微镜下观察，挑取单个萌发的分生孢子，将其转移到PDA平板上继续培养［25］。

1.2.3 分子生物学鉴定法 收集单胞分离培养获得的培养物菌丝，利用真菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，于-20 ℃贮存备用。用真菌通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）扩增序列，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，EB（溴乙锭）染色观察，引物合成与测序工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。采用25 μL反应体系： 2 × Power Taq PCR Master Mix（Bio Teke®）12.5 μL，10 μmol/L引物1 μL，DNA模板1.5 μL，无菌水9 μL。PCR扩增反应程序：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共30个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保温。PCR产物测序结果采用Lasergene软件完成序列检查、校对、剪切以及拼接，将本试验获得的ITS序列在GenBank中进行BLAST同源比对分析，选取同源性最高的序列为参考序列，将上述代表序列及其参考序列进行多重序列比对，采用Mega（V 7. 0. 26）应用软件进行聚类分析，通过邻接法（Neighbor-Joining，NJ）［26-29］构建系统进化树，自展值为1 000。根据查询到的同源序列判定所属物种，代表序列提交GenBank获得序列号。

2 结果与分析

2.1 杉木叶斑病症状

杉木叶斑病病斑随机分布于叶片背面或嫩枝上，初期的叶片病斑呈褐色斑点隆起，斑点逐渐扩大，中后期形成浅褐色，近圆形、梭形或不规则近长条形，边缘为红褐色（图1A至图1F）。后期的病斑长中轴线部位隆起出现唇形裂口，有些裂口处可见少许白色菌丝，病斑部位的叶片组织变得疏松，植物细胞坏死（图1G）。杉木叶斑病病原除侵染叶片外，还侵染杉木小枝，发病严重时小枝枯死，病情扩展后，整株杉木枯萎死亡。

2.2 杉木叶斑病病原菌形态

病原菌产孢体埋生于叶片内，具有裂缝的病斑叶片组织内有的能观察到黑色颗粒状或棒状的产孢体，周围有少量白色菌丝粘连在坏死的叶片组织上，产孢体可轻易剥离（图1G至图1J），其内部可观察到许多分生孢子，未观察到产孢细胞，分生孢子大小为（9.0～13.5） μm×（4.0～6.0） μm（n=30），浅棕色，短棒状或近似圆柱形，顶部钝圆，具3个横膈膜，间隔处有缢缩，内有油滴（图1K至图1O）。

如图2所示，单孢分离培养48 h后，分生孢子在水琼脂平板上开始萌发，萌发的孢子形态与产孢体内的分生孢子一致（图2C和图2F）。5～7 d后，在水琼脂平板形成的菌落起初为圆形，贴附生长，毛茸状，初期白色后变浅灰色，边缘平滑，正面菌落中心为灰色，边缘白色，反面菌落中心为深灰色，边缘白色具环状。萌发的分生孢子转移到PDA平板30～35 d后，菌落的颜色变深呈黄色、灰色至浅棕色，菌落正面同心环带状，部分菌落中心分泌淡黄色或浅棕色透明液滴（图2E）。

将杉木叶斑病样本的病原菌分生孢子形态特征与已报道的病原菌形态进行比较［30-33］，结果（表1）表明，该病原菌的孢子形态与贵州省的Phragmocamarosporium platani和云南省的Phragmocamarosporium magnoliae在大小上有所差异，明显小于Phragmocamarosporium magnoliae，略小于Phragmocamarosporium platani，而病原菌的分生孢子形态、菌丝形态和培养物菌落颜色则接近于Phragmocamarosporium platani。

2.3 病原菌分子生物学特征

单孢分离获得培养物（编号：SL030），提取DNA后对培养物rDNA-ITS区域进行PCR扩增，获得长度约为1 150 bp的序列，根据电泳结果发现无引物二聚体（图3），说明引物特异性较好，可以进行测序。将序列不佳的两端序列去除后拼接，得到长度847 bp的片段，提交序列至GeneBank，获得序列号0R885567。

经ITS序列在NCBI网站BLAST同源性比对结果显示，该序列与Phragmocamarosporium属的Phragmocamarosporium hederae、Phragmocamarosporium qujingensis、Phragmocamarosporium magnoliae这3个种的相似度高达99%以上［30-33］。以ITS序列构建系统发育树，聚类结果比对分析显示，本研究样本病原菌培养物SL030与Phragmocamarosporium platani和Phragmocamarosporium magnoliae这2个种聚为一支，亲缘关系最近（图4）。

3 讨论

本研究结合形态学和分子生物学技术，将滇东北地区的永善县国有林场杉木叶斑病的病原菌鉴定为Wijayawardene［30］，属于2015年发现的子囊菌门（Ascomycota）格孢腔菌目（Pleosporales）扁囊壳菌科（Lentitheciaceae）新属Phragmocamarosporium 的1个种。目前，Phragmocamarosporium属仅报道有5个种，分别在常春藤、铁树、法国梧桐、蔷薇、玉兰上为害［30-33］，这是首次发现在自然条件下Phragmocamarosporium属真菌能够引起杉木叶斑病的发生。

本研究还利用rDNA-ITS序列对Phragmocamarosporium属进行系统发育分析，但该序列未能将病原菌准确鉴定到种。因此，对Phragmocamarosporium属Phragmocamarosporium aff. platani进行准确鉴定还需探索更多保守性较强的特异性基因位点。同时，Phragmocamarosporium aff. platani 在杉木上的致病性还需进一步检测。本研究结果可为Phragmocamarosporium属Phragmocamarosporium aff. platani的进一步研究和云南省永善县国有林场杉木叶斑病的综合防控提供理论基础和依据。

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