响应面法优化金枪鱼鱼骨肽提取工艺研究

摘要：以超低温金枪鱼鱼骨为原料，利用酶法提取制备金枪鱼鱼骨肽，筛选复合蛋白酶为最佳提取用酶，在单因素试验的基础上，以加酶量、酶解温度、酶解时间为自变量，以金枪鱼鱼骨肽提取率为响应值，基于Box-Behnken中心组合原理，采用响应面法优化提取工艺，确定了最佳酶解工艺条件为复合蛋白酶添加量625 U/g、酶解时间5.5 h、酶解温度50 ℃，在该条件下测得金枪鱼鱼骨肽的提取率为34.58%，制备的金枪鱼鱼骨肽中低聚肽含量为91.7%，分子量≤1 kDa的低聚肽占比98.7%，金枪鱼鱼骨肽中游离氨基酸含量为10.66 g/100 g，呈味氨基酸和必需氨基酸含量相对较高，分别为26.4%和48.1%，是一种极具开发价值的海洋生物资源。

关键词：金枪鱼鱼骨肽；提取工艺；响应面优化试验

中图分类号：TS201.1""""" 文献标志码：A"""" 文章编号：1000-9973（2024）09-0138-06

Optimization of Extraction Process of Tuna Fish Bone Peptide by

Response Surface Method

LIU Meng1， ZHU Lai-jing1， WANG Yan-li1， YU Hai-tao2， KE Ben-hong3， ZHAO Xiang-zhong1*

（1.School of Food Science and Engineering， Qilu University of Technology （Shandong Academy

of Sciences）， Jinan 250353， China; 2.Shandong Withinpeak Food Technology Co.， Ltd.，

Weihai 264211， China; 3.Shandong Zhonglu Oceanic （Yantai） Foods Co.， Ltd.，

Yantai 264000， China）

Abstract： Using ultra-low temperature tuna fish bone as the raw material， tuna fish bone peptide is extracted and prepared by enzymatic method， and complex protease is selected as the best enzyme for extraction. On the basis of single factor test， with enzyme addition amount， enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time as the independent variables， with the extraction rate of tuna fish bone peptide as the response value， the extraction process is optimized by response surface method based on Box-Behnken central combination principle， and the optimal enzymatic hydrolysis process conditions are determined as follows： the addition amount of complex protease is 625 U/g， the enzymatic hydrolysis time is 5.5 h and the enzymatic hydrolysis temperature is 50 ℃. Under these conditions， the extraction rate of tuna fish bone peptide is 34.58%， the oligopeptide content of the prepared tuna fish bone peptide is 91.7%， the oligopeptide with molecular weight ≤1 kDa accounts for 98.7%， the content of free amino acids of tuna fish bone peptide is 10.66 g/100 g， and the content of flavor amino acids and essential amino acids is relatively high， which is 26.4% and 48.1% respectively. It is a kind of marine biological resource with great exploration value.

Key words： tuna fish bone peptide; extraction process; response surface optimization test

收稿日期：2024-03-14

基金项目：齐鲁工业大学（山东省科学院）-威海市产学研协同创新基金（2021CXY-03）

作者简介：刘萌（1998—），女，硕士，研究方向：蛋白质工程。

*通信作者：赵祥忠（1969—），男，副教授，硕士，研究方向：海洋食品与生物技术。

金枪鱼又名吞拿鱼，主要分布于太平洋、大西洋、印度洋一带，是大洋暖水性洄游鱼类。近年来，全世界金枪鱼年捕捞量在478万吨以上[1]，2020年我国远洋金枪鱼渔获量高达32.74万吨，占远洋渔业年总量的14.1%[2-3]。每年加工金枪鱼罐头30万吨，生食金枪鱼10万吨左右，而且呈逐年上升趋势[4]。金枪鱼是世界上重要的经济鱼类之一，金枪鱼加工按照品种不同主要分为鲣鱼和超低温金枪鱼两大类，鲣鱼主要用于罐头的生产加工，超低温金枪鱼主要用于生食鱼片的生产[5-6]。在超低温金枪鱼加工过程中，边角料主要包括鱼头、鱼骨、鱼皮和血合肉四部分，占鱼总重的50%～60%[7]，冷云等[8]、张楠等[9]、王聪艳[10]分别利用鱼皮制备了金枪鱼胶原蛋白肽；辛建美[11]、吕乐等[12]、李桂芬等[13]、徐茂琴等[14]开展了对金枪鱼碎肉和血合肉的酶解研究；而占鱼重10%的鱼骨[15]一直未得到较好的开发利用，造成资源的大量浪费。贾建萍等[16]测定了金枪鱼鱼骨的营养成分，鲜味氨基酸（Glu和Asp）含量为17.06%，甜味氨基酸（Gly和Ala）含量为27.98%，表明金枪鱼鱼骨酶解液具有潜在的呈味特性，可用于水产调味料的开发利用。本研究以金枪鱼鱼骨为原料，经破碎处理后采用复合酶酶解，优化提取制备金枪鱼鱼骨肽，以期实现金枪鱼鱼骨的高值化利用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金枪鱼鱼骨：山东省中鲁远洋（烟台）食品有限公司；中性蛋白酶（酶活力：20万U/g）、风味蛋白酶（酶活力：30万U/g）：诺维信（中国）生物技术有限公司；胰蛋白酶（酶活力：4 000 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；碱性蛋白酶（酶活力：30万U/g）：南宁东恒华道生物科技有限责任公司；复合蛋白酶（胰蛋白酶-中性蛋白酶-氨肽酶三者复合，酶活力：10万U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司。

HH-S6数显恒温水浴锅 常州国宇仪器制造有限公司；YGNJ-300骨泥机 青岛海云天机械设备有限公司；BXM-110FL立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HT200高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；PHS-23S数显pH计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 金枪鱼鱼骨粉成分的测定

蛋白质的测定：参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》。

脂肪的测定：参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》。

灰分的测定：参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》。

分子量分布、低聚肽、游离氨基酸的测定：参照GB/T 22729—2008中规定的方法。

1.2.2 金枪鱼鱼骨酶解工艺

1.2.2.1 工艺流程

新鲜的金枪鱼鱼骨→冷冻→破碎→冷冻干燥→金枪鱼鱼骨粉→复配→控温酶解→灭酶→离心分离→上清液→脱色→真空浓缩→喷雾干燥→金枪鱼鱼骨肽粉。

1.2.2.2 操作步骤

选取新鲜的金枪鱼鱼骨，于－60 ℃的超低温冷库中冷冻12 h，用骨泥机粉碎至100目以上，制得鱼骨浆，将鱼骨浆冷冻干燥，制得粉末状的金枪鱼鱼骨粉。精确称取2 g（精确到0.001 g）鱼骨粉加入一定比例的蒸馏水，调节pH后加入蛋白酶，在50 ℃下酶解，酶解后采用100 ℃灭酶5 min，水浴冷却至35 ℃时以8 000 r/min离心10 min，收集上清液加入0.5%的活性炭脱色处理，过滤后将上清液进行真空浓缩，然后喷雾干燥制得金枪鱼鱼骨肽粉。

1.2.3 金枪鱼鱼骨肽提取率的测定

取洁净干燥的培养皿，称量质量m0；将离心收集的酶解液倒入上述培养皿中，冷冻干燥后称量质量ml；然后用蒸馏水将冻干样品复溶，用0.45 μm的微孔膜过滤，将滤液移入50 mL容量瓶中，定容摇匀，测定游离氨基酸含量m2，计算多肽提取率。

鱼骨肽提取率（%）=（m1－m0－m2）/M×100%。

（1）

式中：m0为空培养皿的质量（g）；m1为酶解液冷冻干燥后培养皿的总质量（g）；m2为酶解液中游离氨基酸的质量（g）；M为称取冻干金枪鱼鱼骨粉的质量（g）。

1.2.4 金枪鱼鱼骨肽降解用酶的筛选

以金枪鱼鱼骨粉为原料，选择中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶5种酶在料液比1∶15、加酶量500 U/g、各自最适酶解温度和pH条件下酶解5 h，然后灭酶冷却，离心收集上清液，处理后测定鱼骨肽的提取率，确定鱼骨粉酶解的最佳用酶。

1.2.5 单因素试验

采用复合蛋白酶提取金枪鱼鱼骨肽的影响因素较多，试验中选取加酶量、酶解温度和酶解时间3个影响较大的因素进行单因素试验，考察3个变量对鱼骨肽提取率的影响，得到最优的单因素条件。

1.2.6 响应面试验设计

在复合蛋白酶单因素试验结果的基础上，根据Box-Behnken试验中心设计原理，结合单因素试验结果，以复合蛋白酶加酶量、酶解温度和酶解时间3个因素为自变量，以金枪鱼鱼骨肽提取率（Y）为响应值，使用Design-Expert 13软件设计复合蛋白酶酶解各因素的响应面分析试验。

1.2.7 数据处理

每次试验做3个平行，利用Origin 2017、IBM SPSS、Design-Expert 13进行作图和数据处理分析。

2 结果与分析

2.1 金枪鱼鱼骨粉的营养成分

金枪鱼鱼骨粉营养成分检测结果见表1。

2.2 酶制剂的筛选

由图1可知，影响金枪鱼鱼骨肽提取率的酶的种类顺序为复合蛋白酶gt;胰蛋白酶gt;碱性蛋白酶gt;中性蛋白酶gt;风味蛋白酶；对酶解液品评发现，单独使用碱性蛋白酶和胰蛋白酶会造成酶解液出现较明显的苦味，因此，从金枪鱼鱼骨肽提取率和苦味方面考虑，确定金枪鱼鱼骨肽提取最适用酶为复合蛋白酶。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 加酶量对金枪鱼鱼骨肽提取率的影响

复合蛋白酶酶解条件：料液比为1∶15，pH 为7.0，酶解温度为50 ℃，酶解时间为5 h，自变量加酶量分别为300，400，500，600，700 U/g，试验结果见图2。

由图2可知，随着复合蛋白酶添加量的逐渐增加，金枪鱼鱼骨肽提取率呈现快速上升趋势，当酶添加量达到500 U/g时，鱼骨肽提取率达到34.2%，继续提高加酶量，鱼骨肽提取率增加不明显，逐渐趋于平缓。说明在底物浓度一定的条件下，加酶量与鱼骨肽的提取率呈正相关，但过量的酶不会增加底物与酶的结合位点，不会继续提高鱼骨肽提取率，因此，选择500 U/g为本试验的最适加酶量。

2.3.2 酶解温度对金枪鱼鱼骨肽提取率的影响

由图3可知，随着酶解温度的升高，金枪鱼鱼骨肽提取率呈现快速上升趋势，当酶解温度为50 ℃时，鱼骨肽提取率达到最大值33.9%，然后呈现快速下降趋势。这主要是由于酶解温度与酶活性密切相关，初期温度升高有利于酶活性的发挥，提高了鱼骨肽的提取率，50 ℃为复合酶的最适酶解温度，此时酶活力最大，酶解效果最好，超过50 ℃后继续升高温度会导致酶活降低甚至完全丧失，降低了鱼骨肽的提取率，因此，选择50 ℃为本试验的最适酶解温度。

2.3.3 酶解时间对金枪鱼鱼骨肽提取率的影响

由图4可知，随着酶解时间的延长，金枪鱼鱼骨肽提取率呈现先快速上升后趋于平缓的趋势。在4.0～5.0 h区间内，鱼骨肽提取率从26.9%快速升高到34.2%，继续延长酶解时间到6.0 h，鱼骨肽提取率仍保持上升趋势，但增加量仅为0.6%，说明鱼骨中的蛋白质在5.0 h内基本都被降解成小分子的肽且溶解在酶解液中，因此，选择5.0 h为本试验的最适酶解时间。

2.4 响应面优化

2.4.1 响应面试验设计方案及结果

根据单因素试验结果进行响应面试验设计，响应面试验设计见表2，试验结果见表3。

利用Design-Expert 13对金枪鱼鱼骨肽提取率进行多元回归拟合，得到二次多项式回归模型方程：Y=4.13+0.115 7A－0.181 5B+0.108 4C－0.157 5AB+0.082 2AC－0.196 7BC－0.818 6A2－1.30B2－0.705 5C2。

根据二次多项式回归模型方程，对响应面试验所得到的回归模型方程进行方差分析，并对该模型各系数进行显著性检验，得到的响应面试验方差分析结果见表4。

由表4可知，模型的Plt;0.000 1，说明该回归模型已经达到极显著水平，失拟项的P=0.146 1gt;0.05，失拟项不显著，说明该模型的拟合效果较好。模型一次项A、C极显著，B显著；二次项A2、B2、C2极显著；交互项AB、AC极显著，BC不显著。校正相关系数R2为0.987 2，说明该模型的预测值与试验值具有良好的响应信号。上述数据表明，该试验得到的模型与试验数据拟合较好，可用该模型优化和预测工艺参数，并利用该模型得到从金枪鱼鱼骨中提取鱼骨肽的最佳试验研究工艺。一次项中，加酶量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）这3个因素对鱼骨肽提取率影响的主次顺序为Agt;Cgt;B。

2.4.2 各因素之间交互作用及优化

通过Design-Expert 13软件对金枪鱼鱼骨肽提取率进行分析并绘制多元回归模型方程的响应曲面图，由响应曲面图可以得出结论：三因素三水平的交互作用对响应值的影响不是单一的线性关系，可以根据响应面的陡峭程度来判断3个因素交互作用的强度。响应曲面图中曲线越弯曲说明因素对响应值的影响越大，等高线呈椭圆形说明因素间的交互作用显著，等高线呈圆形说明因素间的交互作用不显著，每条曲线上提取物质量相同，图形颜色的改变与提取物质量相关，结果见图5～图7。

由图5～图7可知，复合蛋白酶的加酶量与酶解温度交互作用的响应面曲图曲线较弯曲，等高线图呈椭圆形，说明当复合蛋白酶的加酶量一定时，随着酶解温度的持续升高，鱼骨肽的提取率先逐渐增大，随后减小；当酶解温度保持不变时，鱼骨肽的提取率随着复合蛋白酶加酶量的增加而增大，达到最大值后逐渐减小，表明两者交互作用对响应值的影响显著。复合蛋白酶的加酶量与酶解时间交互作用的响应面曲线较平坦，等高线呈现圆形，说明当酶解时间一定时，随着加酶量的增加，鱼骨肽的提取率随之增加，达到最大值后逐渐变小；当加酶量一定时，鱼骨肽的提取率随着酶解时间的延长而升高，达到最大值后逐渐减小，表明两者交互作用对响应值的影响不显著。酶解温度与酶解时间交互作用的响应面曲线弯曲程度较大，等高线呈现椭圆形，当酶解温度一定时，鱼骨肽的提取率随着酶解时间的延长而增加，达到最大值后开始减小；当酶解时间一定时，鱼骨肽的提取率随着酶解温度的升高而逐渐增大到最大值，随后逐渐减小，表明两者交互作用对响应值的影响非常显著。

2.4.3 响应面最佳条件验证试验

根据响应面分析得到最优酶解条件为酶添加量626.51 U/g、酶解时间5.51 h、酶解温度50.02 ℃，在此条件下最终试验测得金枪鱼鱼骨肽提取率为34.31%。为了便于实际操作，将酶解条件修正为酶添加量 625 U/g、酶解时间5.5 h、酶解温度50 ℃。在该条件下进行3次平行试验，测得水解度为34.58%，与理论值接近，表明该模型适用于金枪鱼鱼骨肽酶解工艺的分析和预测。

2.5 金枪鱼鱼骨肽分子量分布和游离氨基酸检测

对酶解后的金枪鱼鱼骨肽进行了分子量分布和低聚肽含量检测，结果见图8、表5和表6。

由图8和表5可知，采用提取优化工艺制备的金枪鱼鱼骨肽主要以小分子低聚肽为主，其中分子量≤1 kDa的低聚肽占比98.7%。由表6可知，提取的金枪鱼鱼骨肽中低聚肽含量占比较高，为91.7%，游离氨基酸含量为10.66 g/100 g，游离氨基酸中，精氨酸、亮氨酸、丙氨酸、赖氨酸含量相对较高，呈味氨基酸含量占比为26.4%，必需氨基酸含量占比为48.1%，开发利用价值较高。

3 结论

本文以超低温金枪鱼鱼骨为研究对象，优化了金枪鱼鱼骨肽的提取工艺，进行了金枪鱼鱼骨肽分子量分布、低聚肽含量和游离氨基酸含量的检测。通过试验确定最佳用酶为复合蛋白酶，利用响应面优化设计得出最佳酶解工艺条件为加酶量625 U/g、酶解时间5.5 h、酶解温度50 ℃、料液比1∶15、pH 7.0，在此条件下试验测得金枪鱼鱼骨肽提取率为34.58%；采用该优化工艺制备的金枪鱼鱼骨肽中低聚肽含量为91.7%，分子量≤1 kDa的低聚肽占比为98.7%，游离氨基酸含量为10.66 g/100 g，呈味氨基酸和必需氨基酸含量相对较高，是一种极具开发潜力的优质海洋蛋白肽资源。

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