海南草豆蔻挥发油化学成分分析及对单增李斯特菌抑菌性的研究

摘要：分析海南草豆蔻挥发油的化学成分种类和含量，明确挥发油对单增李斯特菌的抑菌活性。采用水蒸气蒸馏法提取草豆蔻挥发油，利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）检测和分析其化学成分。采用滤纸片扩散法测定单增李斯特菌对挥发油的药物敏感性，采用微量二倍稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。结果表明，草豆蔻挥发油得率为1.26%，分离鉴定出107种化合物，草豆蔻挥发油对单增李斯特菌的抑菌圈直径为15.44 mm，为高敏感性，MIC和MBC分别为0.078，0.312 5 mg/mL。海南草豆蔻挥发油得率较高，挥发性化学成分种类丰富，并且对单增李斯特菌具有较好的抑菌效果。该研究为优异草豆蔻品种的选育提供了数据支持，同时也为草豆蔻挥发油在天然食品抗菌剂开发中的应用提供了理论基础和参考。

关键词：草豆蔻；海南；挥发油；化学成分；GC-MS；单增李斯特菌；抑菌活性

中图分类号：TS255.1 """""文献标志码：A """"文章编号：1000-9973（2024）09-0089-07

Analysis of Chemical Components of Volatile Oil from Hainan Alpinia

katsumadai Hayata and Study on Its Antimicrobial Activity

Against Listeria monocytogenes

WANG Dan， DING Shu-xian， JIANG Qian， WANG Xue-feng， WANG Qing-long，

WANG Mao-yuan， CHEN Xiao-lu， ZHAO Jian-ping*， YU Fu-lai*

（Tropical Crops Germplasm Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key

Laboratory of Biology and Cultivation of Chinese Herbal Medicines， Ministry of Agriculture and

Rural Affairs/Hainan Provincial Engineering Research Center for Tropical Medicinal Plants，

Haikou 571101， China）

Abstract： The types and content of chemical components of volatile oil from Hainan Alpinia katsumadai Hayata are analyzed， and the antimicrobial activity of volatile oil against Listeria monocytogenes is determined. The volatile oil is extracted from Alpinia katsumadai" Hayata by steam distillation method and its chemical components are detected and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The drug sensitivity of Listeria monocytogenes to volatile oil is determined by filter paper diffusion method， and the minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） are determined by trace double dilution method. The results show that the yield of volatile oil from Alpinia katsumadai" Hayata is 1.26%， and 107 compounds are isolated and identified. The inhibitory zone diameter of volatile oil against Listeria monocytogenes is 15.44 mm， indicating that it has high sensitivity. MIC and MBC are 0.078， 0.312 5 mg/mL respectively. The yield of volatile oil from Hainan Alpinia katsumadai

Hayata is higher， the types of volatile chemical components are rich， and it has a good antimicrobial effect on Listeria monocytogenes. This study has provided data support for the breeding of excellent Alpinia katsumadai Hayata varieties， and also provided theoretical basis and references for the application of volatile oil from Alpinia katsumadai Hayata in the development of natural food antimicrobial agents.

Key words： Alpinia katsumadai Hayata; Hainan; volatile oil; chemical components; GC-MS; Listeria monocytogenes; antimicrobial activity

收稿日期：2024-04-23

基金项目：海南省重点研发计划项目（ZDYF2024SHFZ132）；中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所非营利项目（PZS2023013）；中国热带农业科学院基本科研业务费专项资金（1630032022008）

作者简介：王丹（1982—），女，黑龙江牡丹江人，副研究员，研究方向：南药资源研究与开发。

*通信作者：赵建平（1965—），男，云南石林人，研究员，研究方向：热带作物产品加工与贮藏；

于福来（1983—），男，吉林长春人，研究员，博士，研究方向：南药资源定向培育及开发利用。

草豆蔻（Alpinia katsumadai Hayata）是姜科山姜属植物草豆蔻的干燥近成熟种子，主产地为海南、广东、广西和云南，具有燥湿行气、温中止呕的功效[1-2]。同时，草豆蔻是我国传统的药食同源中药，是非常重要的香辛料和食品调味料。近年来，随着草豆蔻市场需求的增加，草豆蔻野生和半野生状态的药材产量不稳定、质量差异大等问题凸显出来。因此，急需筛选出药效成分稳定、生物活性高的优异草豆蔻种质。

《中华人民共和国药典》（2020版一部）规定，挥发油是草豆蔻的主要药效成分之一，药材挥发油含量不得少于1.0%（mL/g）[3]。研究表明，草豆蔻中的挥发油具有保护胃黏膜、抗胃溃疡、抗炎、抑菌等作用[4-6]。魏洁书等[7]研究发现草豆蔻种子团挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑制效果。彭芙等[8]研究证实草豆蔻挥发油可以抑制奶牛乳腺炎病原菌。此外，褚祚晨[9]发现草豆蔻的挥发油微乳液对香蕉炭疽病有很好的抑制作用，对香蕉有一定的保鲜作用。但是，有关草豆蔻挥发油对食源性致病菌单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）的抑制作用未见报道。单增李斯特菌属于革兰氏阳性菌，其容易感染肉类、蛋类、海产品、乳制品等绝大多数食品，且对抗菌剂的抗性较强[10]，可引发李斯特菌病，致死率高达20%～30%，是发达国家列为重点控制的食源性疾病[11-12]。

因此，本研究以农业农村部（海南儋州）中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所药用植物种质资源圃筛选出的草豆蔻优异种质资源为材料，以水蒸气蒸馏法提取其干燥种子精油，采用GC-MS分析和鉴定草豆蔻精油的挥发性成分，并研究草豆蔻挥发油对食源性致病菌单增李斯特菌的抑菌作用，为后续草豆蔻优异品种选育和天然抗菌剂的开发应用提供了一定的理论基础和数据支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

实验所用草豆蔻采样于农业农村部（海南儋州）中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所药用植物种质资源圃，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所王茂媛研究员鉴定为姜科植物草豆蔻（Alpinia katsumadai Hayata）的干燥近成熟种子。

1.2 试剂和菌种

无水乙醇、过二硫酸钾：西陇科学股份有限公司；2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）：上海麦克林生化科技有限公司；抗坏血酸（VC）、2，2-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）：北京索莱宝科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）：东京化成工业株式会社；总抗氧化能力（FRAP法）试剂盒：苏州科铭生物技术有限公司；AR0030 PBS缓冲液：武汉博士德生物工程有限公司；氨苄青霉素：Biosharp生物科技公司。

实验用单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）：北京北纳创联生物技术研究院。

1.3 主要仪器与设备

F-100SD超声波清洗机 深圳福洋科技集团有限公司；ME104E/02电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Tecan/Spark 10M多功能酶标仪 瑞士Tecan公司；N4S紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 挥发油提取

取草豆蔻干燥种子，用粉碎机打粉后过筛。根据前期实验结果，确定以料液比1∶10将150 g果粉与1 500 mL去离子水混合于圆底烧瓶中，用保鲜膜封口后超声30 min，功率360 W，温度30～40 ℃。超声后，采用电热套于230 ℃加热，水蒸气蒸馏5 h，待冷却后取出挥发油，用无水硫酸钠干燥水分后转入棕色瓶中密封，放入4 ℃冰箱中避光保存。挥发油得率计算公式如下：

挥发油得率（%）=挥发油质量（g）/样品质量（g）×100%。

1.4.2 挥发油GC-MS分析

取50 μL提取的草豆蔻挥发油，用异丙醇溶解，配制成浓度为2.5%的溶液，进行GC-MS分析。

1.4.2.1 色谱条件

采用Agilent 7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪对草豆蔻挥发油成分进行测定。采用VF-WAXms色谱柱（0.25 mm×30 mm，0.25 μm）。以60 ℃为起始温度，保持1 min；以4 ℃/min升温至150 ℃，再以6 ℃/min升温至230 ℃；进样口温度为230 ℃；进样量为1.0 μL，分流比为8∶1。

1.4.2.2 质谱条件

离子源为EI源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV，接口温度230 ℃，倍增管电压1 043 V，采集类型为全扫描，质量范围30～400 amu。

1.4.3 抑制单增李斯特菌活性测定

1.4.3.1 抑菌圈的测定

采用滤纸片扩散法，在无菌环境下，用移液枪吸取15 μL草豆蔻挥发油滴在直径为6 mm的无菌滤纸片上，待纸片充分吸收后贴在已涂布菌液的胰酪大豆胨琼脂（TSA）培养基平板上，并标记好各药液的名称，每个药液重复3次，菌液浓度为107 CFU/mL，菌液涂布量为60 μL。重复3次并标记好编号。阴性对照组为100%乙醇，阳性对照组为氨苄青霉素（浓度为0.04 mg/mL），培养条件为在37 ℃恒温培养箱中培养12 h。培养结束后观察并记录抑菌圈的有无，采用十字交叉法测量抑菌圈直径大小，取平均值作为测定结果。

抑菌圈测定标准：抑菌圈直径大于20 mm为极敏，直径在15～20 mm之间为高敏，直径在10～15 mm之间为中敏，直径小于10 mm为低敏。

1.4.3.2 最低抑菌浓度（MIC）的测定

在96孔培养板上采用微量二倍稀释法进行MIC实验，将草豆蔻挥发油溶于无水乙醇，分别配制成400，100，50，10，5 mg/mL的草豆蔻挥发油溶液。将96孔板上的A1孔作为起始孔，A、B、C、E、F、H 6排从左到右12个孔分别加入胰酪大豆胨液体（TSB）培养基100 μL。在A、B、C、H排的第一孔中加入100 μL配制好的草豆蔻挥发油溶液，在E、F排的第一孔中加入氨苄青霉素100 μL充分混匀至乳化，依次对1～12孔做梯度稀释，充分混匀后在每孔中加入100 μL菌液（A～C为3个重复，E、F为阳性药物对照，H为确认草豆蔻挥发油颜色是否有影响），在另一个96孔培养板的任意两排用100%乙醇进行二倍稀释作为阴性对照，再选两排的1～6孔分别加入50，75，88，94，97，98 μL的培养基后，在每孔中再加入100 μL菌液作为空白对照，用封口膜封好后标记，在37 ℃培养箱中培养12 h后，使用酶标仪测定样品的吸光度值，抑菌率达到80%的样品浓度为草豆蔻挥发油对单增李斯特菌的最低抑菌浓度（MIC）。

1.4.3.3 最低杀菌浓度（MBC）的测定

采用琼脂培养基平板法，吸取50 μL 1.4.3.2中各样品MIC所对应的溶液均匀涂布于琼脂培养基中，培养条件为在37 ℃恒温培养箱中培养12 h，观察培养基中有无菌株生长，草豆蔻挥发油的MBC为菌落数低于5个的平板所对应孔中的最低浓度。

2 结果与分析

2.1 草豆蔻挥发油得率

草豆蔻种子挥发油得率为1.26%，满足《中华人民共和国药典》中的规定，显著高于其他文献报道中采用水蒸气蒸馏法提取获得的草豆蔻挥发油得率，晏小霞等[13]的研究中草豆蔻种子挥发油得率为0.72%，魏洁书等[7]的实验中草豆蔻挥发油得率为0.73%，进一步说明了草豆蔻药材质量的差异很大，本实验的草豆蔻药材品质较好。

2.2 草豆蔻挥发油成分及分析

草豆蔻挥发油经GC-MS分析后总离子流图见图1，草豆蔻挥发油成分分析和相对含量见表1。

由表1可知，从草豆蔻挥发油中鉴定出107种化合物。挥发油主要包含萜类、醇类、芳香族以及少量的酸类、酯类、酮类、萘类等化合物。其中萜类化合物61种，主要为单萜类、倍半萜类化合物，相对含量占挥发油总量的76.10%。挥发油中相对含量较高的为桉叶油素（9.36%）、Z，Z，Z-1，5，9，9-四甲基-1，4，7-环十一碳三烯（9.27%）、伞花烃（7.67%）、α-水芹烯（7.30%）、法尼醇（5.71%）、石竹烯（4.59%）、α-松油醇（4.27%）等，相对含量占挥发油总量的48.16%。

从草豆蔻挥发油中鉴定出的化学成分与文献报道的化学成分类别、数量和相对含量差异较大，晏小霞等[13]从草豆蔻挥发油中鉴定出47种化合物，其中单萜类20种，倍半萜类8种，分别占挥发油总量的30.56%和26.79%，并且主要化合物的含量差异也较大，如法尼醇（18.02%）、1，8-桉叶油素（13.94%）、月桂酸（9.25%）、棕榈酸（8.58%）、肉豆蔻酸（7.37%）等。于萍等[14]从草豆蔻精油中鉴定出42种化合物，主要是法尼醇（19.83%）、桉叶油素（12.52%）、2-苯基-2-丁酮（4.48%）、β-蒎烯（4.68%）、3-蒈烯（4.68%）等。这些差别可能与草豆蔻种质、品质、产地、气候的不同有着密切关系[15-18]。

2.3 草豆蔻挥发油对单增李斯特菌抑菌活性分析

通过药物在培养基平板上的扩散能力，根据抑菌圈大小判定待测药物的抑菌效价，即药物对该菌种的敏感性。草豆蔻挥发油对单增李斯特菌的抑菌圈直径见图2。

由图2可知，草豆蔻挥发油对单增李斯特菌的抑菌圈直径为（15.44±1.50） mm，为高敏，但是低于阳性对照药物氨苄青霉素（28.91±0.62） mm，阴性对照组没有抑菌效果。草豆蔻挥发油的MIC和MBC分别为0.078，0.312 5 mg/mL，虽然低于阳性对照组，但是优于其他植物精油，张承慧[19]研究发现，丁香精油对单增李斯特菌的MIC和MBC分别为0.5，1.0 mg/mL；洪小利等[20]证实肉桂精油对单增李斯特菌的MIC为0.2 mg/mL，说明草豆蔻挥发油对单增李斯特菌的抑菌效果优于其他植物精油。然而，刘晓丽等[21]利用超临界CO2法萃取的黑胡椒、肉桂和丁香精油的MIC分别为0.048，0.072，0.096 mg/mL，且三者复配的复合精油对单增李斯特菌的MIC为0.016 mg/mL。说明采用不同的提取方法会导致所提取的挥发油化学成分存在一定差异，进而可能导致其抑菌活性的不同。

进一步结合GC-MS结果，据研究报道，草豆蔻挥发油中主要成分桉叶油素、α-水芹烯、法尼醇、石竹烯、α-松油醇、右旋萜二烯、2-茨酮、芳樟醇、莰烯、辛酸等成分具有不同程度的抑菌作用[22-25]，这可能是挥发油中单一抑菌成分或多种抑菌成分共同作用的结果，这可能是导致草豆蔻挥发油对单增李斯特菌具有显著抑制作用的原因，具体机制还需进一步研究。

3 结论

目前，在海南等草豆蔻的主产区，草豆蔻主要资源仍处于野生和半野生状态，导致药材来源、种质性状、产量和质量等不稳定，药材品质差异很大，因此，亟需优异的草豆蔻种质和品种。挥发油是草豆蔻的主要有效成分之一，其含量与草豆蔻品质有关。不同提取方法或工艺条件对草豆蔻挥发油成分种类、含量的影响存在较大差异，可根据产品的需求选择不同的提取方法和工艺条件。本实验采用水蒸气蒸馏法所获得的草豆蔻挥发油得率为1.26%，优于《中华人民共和国药典》中的规定和以往研究报道，并且由于草豆蔻挥发油成分丰富，具有107种挥发性成分，对单增李斯特菌显示出较优的抑菌活性，为下一步优异品种的选育提供了理论基础和数据支撑，同时也为草豆蔻挥发油在天然食品抗菌剂开发中的应用提供了一定的数据支持和参考。

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