脂肪间充质干细胞外囊泡通过增加LC3B表达对人微血管内皮细胞损伤的影响

摘要 目的：探讨低氧微环境诱导下脂肪间充质干细胞（ADSCs）外囊泡（Evs）通过增加微管相关蛋白轻链3B（LC3B）表达对人微血管内皮细胞损伤的保护作用。方法：分离大鼠ADSCs，并通过成骨、成脂分化和细胞表面标志物的表达进行鉴定。利用常氧（21%O2）和低氧（1%O2）条件分别获得常氧Evs和低氧Evs，通过形态和表面标志物的表达进行鉴定。构建心肌微血管内皮细胞（CMECs）细胞氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型，并将CMECs分为对照组（Control组）、氧糖剥夺/再灌注组（OGD/R组）、常氧Evs组（N-Evs组，给予常氧Evs培养24 h）、低氧Evs组（H-Evs组，给予低氧Evs培养24 h）、低氧Evs＋自噬抑制剂组（H-Evs＋3-MA组，给予低氧Evs和3-MA 5 mmol/L培养24 h）。采用细胞计数试剂盒（CCK-8）法、5-乙炔基-2-脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色、划痕实验、Transwell实验、管腔形成实验和透射电镜分别检测CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成和自噬能力；采用酶联免疫吸附法（Western Blot）检测增殖细胞核抗原（PCNA）、Ki67、基质金属蛋白酶（MMP）-2/MMP-9、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）、LC3B、重组人自噬效应蛋白1（Beclin1）蛋白表达。结果：与Control组比较，OGD/R组CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成、自噬能力减弱（P＜0.05），PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达减少（P＜0.05）。与OGD/R组比较，N-Evs组和H-Evs组CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成、自噬能力增强（P＜0.05），PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达增加（P＜0.05），且H-Evs组优于N-Evs组（P＜0.05）。与H-Evs组比较，H-Evs＋3-MA组CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成、自噬能力减弱（P＜0.05），PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达减少（P＜0.05）。结论：低氧微环境诱导下的ADSCs-Evs通过增加LC3B表达可促进OGD/R损伤CMECs的增殖、迁移、侵袭、血管形成和自噬能力。

关键词 心肌微血管内皮细胞；脂肪间充质干细胞；外囊泡；低氧微环境；大鼠；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.14.011

Effect of Extracellular Vesicles in Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells on Human Microvascular Endothelial Cells Injury by Increasing LC3B Expression

LIU Liang， LIN Yu， LIN Tong， YANG Jianming， WENG Yuhui

Fuqing City Hospital Affiliated to Fujian Medical University， Fuqing 350300， Fujian， China

Corresponding Author WENG Yuhui， E-mail： liuliang998866@163.com

Abstract Objective：To investigate the protective effect of extracellular vesicles（Evs） in adipose-derived mesenchymal stem cells（ADSCs） induced by hypoxic microenvironment on human microvascular endothelial cells injury by increasing the expression of microtubule-associated protein light chain 3B（LC3B）.Methods：The rat ADSCs were isolated and identified by osteogenic differentiation，lipogenic differentiation and expression of cell surface markers.Normoxic Evs and hypoxic Evs were obtained under normal oxygen（21% O2） and hypoxic oxygen（1% O2） conditions respectively，and identified by the expression of morphology and surface markers.The oxygen-glucose deprivation/reperfusion（OGD/R） model of cardiac microvascular endothelial cells（CMECs） was constructed，and CMECs were divided into Control group，OGD/R group，N-Evs group，hypoxic Evs group（H-EVS group，hypoxic Evs culture for 24 h），hypoxic Evs＋autophagy inhibitor group（H-EVS＋3-MA group，hypoxic Evs and 3-MA 5 mmol/L culture for 24 h）.The proliferation，migration，invasion，angiogenesis and autophagy of CMECs were detected by cell counting kit（CCK-8），5-acetylidene-2-deoxyuracil nucleoside（EdU） staining，scratch test，Transwell test，tubular formation test and transmission electron microscopy.The expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA），Ki67，matrix metalloproteinase（MMP）-2/MMP-9，hypoxia-inducible factor-1 α（HIF-1α），vascular endothelial growth factor（VEGF），LC3B and recombinant human autophagy effect protein 1（Beclin1） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.Results：Compared with the Control group，the proliferation，migration，invasion，angiogenesis and autophagy of CMECs in the OGD/R group were reduced（P＜0.05），and the expressions of PCNA，Ki67，MMP-2/MMP-9，HIF-1α，VEGF，LC3B-Ⅱ/Ⅰ and Beclin1 decreased（P＜0.05）.Compared with the OGD/R group，the proliferation，migration，invasion，angiogenesis and autophagy of CMECs in the N-Evs group and H-Evs group were enhanced（P＜0.05），and the expressions of PCNA，Ki67，MMP-2/MMP-9，HIF-1α，VEGF，LC3B-Ⅱ/Ⅰ and Beclin1 increased（P＜0.05）.These indexes of H-Evs group were better than those of N-Evs group（P＜0.05）.Compared with the H-Evs group，proliferation，migration，invasion，angiogenesis and autophagy of CMECs in the H-Evs＋3-MA group reduced（P＜0.05），while expressions of PCNA，Ki67，MMP-2/MMP-9，HIF-1α，VEGF，LC3B-Ⅱ/Ⅰ and Beclin1 decreased（P＜0.05）.Conclusion：ADSCs-Evs induced by hypoxic microenvironment could promote proliferation，migration，invasion，angiogenesis and autophagy of OGD/R injured CMECs by increasing LC3B expression.

Keywords cardiac microvascular endothelial cells; adipose-derived mesenchymal stem cells; external vesicles; hypoxic microenvironment; rats; experimental study

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）是心肌组织缺血后恢复血液灌注时产生的不可逆损伤，常造成心功能降低，心肌梗死面积扩大，最终导致心力衰竭［1］。MIRI过程中，心肌微血管内皮细胞（cardiac microvascular endothelial cells，CMECs）发生凋亡、坏死，增殖和迁移能力降低，严重破坏微血管的完整性，从而加速心肌细胞的缺血再灌注损伤［2］。因此，抑制缺血/缺氧引起的CMECs凋亡，促进CMECs增殖、迁移、血管形成和自噬对MIRI的治疗尤为关键［3-4］。近年来，旁分泌途径在改善心肌梗死微环境及心肌修复方面发挥着重要作用。外囊泡（extracellular vesicles，Evs）是直径为30～100 nm的囊泡，其形成过程始于细胞膜表面的内吞作用，后经出芽作用包裹特异蛋白及mRNA、miRNA等物质形成多胞体，仅少数多胞体与细胞质膜融合，向胞外释放含脂质双分子层的Evs，包括外泌体（exosomes，Exos）、微囊泡和凋亡小体［5］。脂肪间充质干细胞（adipose-drived stem cells，ADSCs）具有自我更新和多向分化的潜能。有研究证实，ADSCs对心血管疾病的修复作用与其来源的Evs密切相关［6］。Lai等［7］研究显示，ADSCs-Exos可降低过氧化氢（H2O2）诱导的心肌细胞凋亡和肥大。陈晓佳等［8］研究表明，ADSCs-Exos通过抑制缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡，减轻MIRI的心肌损伤。Huang等［9］研究证实，色素上皮衍生因子预处理的ADSCs-Exos可抑制氧糖剥夺/再灌注（oxygen glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）后的SY-5Y细胞及MIRI模型大鼠凋亡。然而，不同应激条件下分泌的Evs，其发挥的生物学效应存在差异［10］。莫壁伶等［11］研究显示，缺氧预处理的ADSCs-Exos较常氧来源的ADSCs-Exos可抑制心肌梗死小鼠心肌细胞凋亡，促进组织血管再生。李朝富等［12］研究表明，与常氧环境下骨髓间充质干细胞（BMSCs）-Exos比较，缺氧预处理的BMSCs-Exos可促进CMECs增殖。然而缺氧预处理的ADSCs-Evs在MIRI中作用研究较少。本研究以OGD/R后的CMECs为研究对象，观察常氧及缺氧微环境诱导下的ADSCs-Evs对微管相关蛋白轻链3B（LC3B）表达和CMECs增殖、迁移、血管生成及自噬的影响，以期为MIRI的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

无特定病原体（SPF）级雄性SD大鼠［中生北动（北京）科技发展有限公司，SYXK（京）2020-0051）］7～8周龄，体质量200～220 g。鼠CMECs（中国科学院上海细胞生物学研究所）；胎牛血清（美国Gibco公司）；杜氏改良Eagle培养基（DMEM）培养基（美国Hyclone公司）；细胞计数试剂盒（CCK-8）、膜联蛋白V（Annexin V-FITC）细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司）；PCNA、Ki67、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2/MMP-9、缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1抗体购自美国Santa Cruz公司；CO2培养箱（美国Thermo公司）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；荧光显微镜（日本Olympus公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；蛋白电泳仪、转膜仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的培养和鉴定

1.2.1.1 ADSCs的分离和培养

大鼠处死后，无菌条件下取腹部脂肪组织，用含青链霉素的磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗，剪碎并用胰酶消化，经100目滤网过滤，离心收集细胞。重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、5%CO2的条件培养，每隔48 h换液1次，当密度达到90%时，使用0.25%胰酶消化传代，取第3代ADSCs进行后续实验。

1.2.1.2 ADSCs的成骨诱导分化

取第3代ADSCs，使用成骨诱导液进行诱导分化，3周后进行ALP和茜素红染色，光学显微镜（×100）下观察染色结节情况。

1.2.1.3 ADSCs的成脂诱导分化

取第3代ADSCs，使用成脂诱导液进行诱导分化，待脂滴变得足够大和圆时，进行油红O染色，光学显微镜（×100）下观察成脂染色效果。

1.2.1.4 ADSCs表面标志物的鉴定

取第3代ADSCs，分别加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD90、CD105、CD45及CD34，应用流式细胞仪检测细胞相应抗原的表达。

1.2.2 ADSCs-Evs的获取和鉴定

1.2.2.1 Evs的获取

取第3代ADSCs，使用去除Evs的10%胎牛血清的DMEM培养基在常氧（21%O2、5%CO2）或低氧（1%O2、94%N2和5%CO2）条件下培养48 h后收集上清液，分别以500×重力加速度（g）、2 000×g、100 000×g离心10 min后收集上清；用0.22 μm滤膜过滤后经超滤（超滤管孔径为100 kDa）浓缩上清。收集浓缩液100 000×g离心2 h。加入适量PBS重悬沉淀（Evs），置于－80 ℃保存。

1.2.2.2 Evs透射电镜的观察

将装载样品的铜网放在滤纸上，加入20 μL的Evs提取液静置3 min，加入30 μL 3%磷钨酸溶液负染5 min。将铜网置于样品室，透射电镜观察Evs形态。

1.2.2.3 Evs表面标志物的鉴定

提取Evs蛋白，蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测Evs表面标志物CD63、CD81的表达。以ADSCs作为对照。

1.2.3 OGD/R的CMECs模型制作与分组

将CMECs分为对照组（Control组）、氧糖剥夺/再灌注组（OGD/R组）、常氧Evs组（N-Evs组）、低氧Evs组（H-Evs组）和低氧Evs＋自噬抑制剂组（H-Evs＋3-MA组）。其中N-Evs组和H-Evs组分别给予含常氧和低氧处理下的ADSCs-Evs，且去除其他Evs的10%胎牛血清的DMEM培养基；H-Evs＋3-MA组给予低氧处理下的ADSCs-Evs和3-MA 5 mmol/L，且去除其他Evs的10%胎牛血清的DMEM培养基；Control组和OGD/R组给予去除其他Evs的10%胎牛血清的DMEM培养基。将CMECs培养24 h。除Control组外，其余各组待细胞融合70%时，进行氧糖剥夺培养6 h（DMEM无糖培养基＋95%N2、5%CO2）；之后复氧复糖培养24 h（含10%胎牛血清的DMEM培养基＋95%空气、5%CO2）。Control组以相同的时间正常培养。

1.2.4 CCK-8法检测CMECs活力

将各组CMECs（5×103/mL）接种于96孔板，于37 ℃、5%CO2条件下培养1、2、3 d。将原培养基更换成含有10%的CCK-8溶液的新鲜培养基。在37 ℃下孵育1 h，检测样品在450 nm处的吸光度。

1.2.5 5-乙炔基-2-脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色检测CMECs增殖

将各组CMECs培养24 h后，按照EdU染色试剂盒说明书，EdU标记2 h、4%多聚甲醛固定30 min、0.5% Triton-100透化10 min、Apollo染色30 min、4′6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色20 min，荧光显微镜下进行拍照，Image J进行细胞计数。

1.2.6 划痕实验检测CMECs迁移

将CMECs（5×105/mL）接种于6孔板，当细胞单壁生长时用枪头划痕，PBS去除划掉的细胞，记录0 h的划痕宽度。培养24 h后再次记录划痕宽度，计算划痕愈合率。

1.2.7 Transwell法检测CMECs侵袭

Transwell小室平铺一层Matrigel基质胶，上室加入无血清培养基培养的各组CMECs（5×105/mL），下室加入含有10%胎牛血清的培养基，并置于37 ℃条件下孵育24 h。经甲醛固定，结晶紫染色后，显微镜下观察和统计穿膜细胞。

1.2.8 管腔形成实验观察CMECs血管生成

将CMECs（5×104/mL）接种于含Matrigel基质胶的96孔板中，置于37 ℃条件下孵育6 h。显微镜下观察细胞小管形成情况，Image J进行管腔计数。

1.2.9 透射电镜检测CMECs自噬小体形成

将CMECs（1×106/mL）接种于6孔板，培养48 h后收集细胞，用2.5%戊二醛于4 ℃固定过夜，之后用1%四氧化锇固定2 h、经梯度乙醇和100%丙酮脱水、丙酮和812包埋剂渗透包埋、60 ℃聚合48 h，制成50～70 nm的超薄切片，经铀铅双染色、室温干燥过夜，于透射电镜（×25 000）下观察各组细胞自噬小体形成情况。

1.2.10 Western Blot检测CMECs相关蛋白表达

取各组CMECs，提取并测定蛋白浓度，蛋白稀释后进行电泳，转聚偏乙烯膜（PVDF），脱脂牛奶中封闭2 h，分别加入增殖细胞核抗原（PCNA）、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1一抗（1∶2 000）4 ℃孵育过夜。经TBST洗涤后，加入二抗（1∶5 000）4 ℃孵育2 h，加入电化学发光（ECL）显色剂显色，凝胶成像仪拍照，Image J软件分析各组蛋白三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的相对表达量。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，GraphPad Prism5.0作图，符合正态分布和方差齐性的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用独立t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ADSCs的形态观察和鉴定

第3代ADSCs形态呈纤维细胞样形态，大小一致；ALP染色显示ADSCs产生蓝紫色染色结节；茜素红染色显示ADSCs产生橙红色致密结节；油红O染色显示ADSCs产生融合变大的红色脂滴。说明ADSCs在成骨和脂肪生成方面诱导成功。ADSCs表面标志物CD90和CD105呈阳性表达（＞90%），造血干细胞标志物CD34和CD45呈阴性表达（＜2%）。上述结果表明大鼠ADSCs培养成功。详见图1、图2。

2.2 ADSCs-Evs形态观察和鉴定

电镜下观察到N-Evs和H-Evs呈典型的圆形和椭圆形结构，H-Evs直径大于N-Evs，直径范围更广。Western Blot结果显示，N-Evs和H-Evs标志特异性蛋白CD81、CD63及膜生成相关复合物TSG101均呈阳性。说明ADSCs-Evs成功分离。详见图3。

2.3 H-Evs促进CMECs增殖

采用CCK-8、EdU染色及Western Blot检测H-Evs对CMECs增殖能力的影响。结果显示，与Control组比较，OGD/R组CMECs 24、48、72 h OD值降低，PCNA、Ki67表达减少（P＜0.05）；与OGD/R组比较，N-Evs组和H-Evs组CMECs 24、48、72 h OD值升高，PCNA、Ki67表达增加（P＜0.05），且H-Evs组对CMECs增殖能力的促进作用强于N-Evs组（P＜0.05）；与H-Evs组比较，H-Evs＋3-MA组CMECs 24、48、72 h OD值降低，PCNA、Ki67表达减少（P＜0.05）。详见图4、图5。

2.4 H-Evs促进CMECs迁移和侵袭

采用划痕实验、Transwell实验及Western Blot检测H-Evs对CMECs迁移、侵袭能力的影响。结果显示，与Control组比较，OGD/R组CMECs划痕愈合率、细胞侵袭数及MMP-2/MMP-9表达减少（P＜0.05）；与OGD/R组比较，N-Evs组和H-Evs组CMECs划痕愈合率、细胞侵袭数及MMP-2/MMP-9表达增加（P＜0.05），且H-Evs组对CMECs迁移、侵袭能力的促进作用强于N-Evs组（P＜0.05）；与H-Evs组比较，H-Evs＋3-MA组CMECs划痕愈合率、细胞侵袭数及MMP-2/MMP-9表达减少（P＜0.05）。详见图6～图9。

2.5 H-Evs促进CMECs血管生成

采用管腔形成实验及Western Blot观察H-Evs对CMECs血管形成能力的影响。结果显示，与Control组比较，OGD/R组CMECs小管形成数量减少，HIF-1α、VEGF表达减少（P＜0.05）；与OGD/R组比较，N-Evs组和H-Evs组CMECs小管形成数量增加，HIF-1α、VEGF表达增加（P＜0.05），且H-Evs组对CMECs血管形成的促进作用强于N-Evs组（P＜0.05）；与H-Evs组比较，H-Evs＋3-MA组CMECs小管形成数量减少，HIF-1α、VEGF表达减少（P＜0.05）。详见图10、图11。

2.6 H-Evs促进CMECs自噬

采用透射电镜及Western Blot检测H-Evs对CMECs自噬能力的影响。结果显示，与Control组比较，OGD/R组CMECs自噬小体数量和LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达减少（P＜0.05）；与OGD/R组比较，N-Evs组和H-Evs组CMECs自噬小体数量和LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达增加（P＜0.05），且H-Evs组对CMECs自噬能力的促进作用强于N-Evs组（P＜0.05）；与H-Evs组比较，H-Evs＋3-MA组CMECs自噬小体数量和LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达减少（P＜0.05）。详见图12、图13。

2.7 H-Evs抑制CMECs损伤的机制

以OGD/R后的CMECs为研究对象，观察常氧及缺氧微环境诱导下的ADSCs-Evs对CMECs增殖、迁移、血管生成及自噬的影响。结果显示，N-Evs和H-Evs通过升高PCNA、Ki67水平促进CMECs增殖；升高MMP-2/MMP-9水平促进CMECs转移；升高HIF-1α、VEGF水平促进CMECs小管生成；升高LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1水平促进CMECs自噬；且H-Evs对CMECs的作用效果强于N-Evs。3-MA可逆转H-Evs对CMECs LC3B表达和自噬的促进作用。说明缺氧微环境诱导下的ADSCs-Evs通过增加LC3B表达对人微血管内皮细胞发挥保护作用。详见图14。

3 讨 论

CMECs具有促进血管生成的作用，在心肌梗死［13］、心肌肥厚［14］等多种心血管疾病中发挥着重要的作用。正常情况下CMECs具有较好的屏障作用；当心肌损伤时，CMECs是各种自由基和炎性因子直接攻击的细胞，保护CMECs有助于减轻MIRI［15］。血管生成是缺血后组织修复的关键过程，因ADSCs促血管生成能力已被广泛用于治疗MIRI［16］。有研究表明，ADSCs通过旁分泌途径产生的Evs具有心肌保护作用［17］。Evs通过促进CMECs增殖及血管生成进而改善心功能。低氧可促进ADSCs的分泌效应，且H-Evs较N-Evs具有强烈的促血管生成作用，在受伤的糖尿病小鼠中，低氧诱导的ADSCs-Evs可增加血管内皮细胞的增殖、迁移和血管再生能力［18］。裸鼠皮下脂肪移植模型中，低氧诱导的ADSCs-Evs较常氧ADSCs-Evs可显著促进脂肪移植物的存活、新生血管的形成和炎症的减轻［19］。在OGD后的脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）中，低氧诱导的ADSCs-Evs能促进BMECs的迁移和管形成能力［20］。本研究通过CCK-8、EdU染色、划痕实验、Transwell实验、管腔形成实验及透射电镜观察低氧和常氧诱导的ADSCs-Evs对OGD/R后的CMECs的影响，结果显示，H-Evs较N-Evs能促进CMECs的增殖、迁移、血管生成和自噬能力。说明低氧提高了ADSCs-Evs对CMECs的保护作用。3-MA可逆转H-Evs对CMECs LC3B表达和自噬的促进作用。说明缺氧微环境诱导下的ADSCs-Evs通过增加LC3B表达，抑制CMECs的增殖、迁移、血管生成和自噬。

CMECs是缺血后心肌组织修复的主要保护细胞，CMECs的生存、增殖、迁移、自噬和管的形成对血管生成至关重要［21］。Ki67是一种增殖细胞的核抗原，常作为细胞增殖活性的可靠标志物。PCNA在启动细胞增殖方面发挥着重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。心肌梗死大鼠模型中，静脉注射MSCs-Exos可缩小心肌梗死面积，减轻心肌梗死诱导的损伤，增加Ki67、PCNA的表达，低氧处理的MSCs-Exos可促进CMECs增殖和血管生成［22］。MMPs可降解细胞外基质，在细胞浸润转移中发挥重要作用，MMP-2/MMP-9水平直接影响细胞的迁移和侵袭能力。在H2O2诱导下的CMECs中，缺氧处理的心肌细胞Exos通过提高PCNA和MMP-2水平，促进CMECs增殖和迁移［23］。VEGF是调节血管形成的重要因子。HIF-1α在低氧条件下可促进VEGF表达，在组织血管新生中发挥着重要作用。在OGD后的内皮细胞和心肌细胞中，MSCs-Exos可抑制VEGF表达，通过促进内皮细胞和心肌细胞的血管生成，防止其缺氧损伤［24］。自噬调节因子包括LC3和Beclin1，其中LC3有3种同工型蛋白（LC3A、LC3B、LC3C）。LC3B-Ⅱ/Ⅰ与自噬小体数量呈正相关。Beclin1过表达可刺激细胞自噬发生。在缺血性心肌细胞和心肌内皮细胞中，MSCs-Exos可降低Beclin1及LC3B-Ⅱ/Ⅰ水平，抑制细胞凋亡，促进细胞自噬和内皮细胞的管形成能力［25］。本研究中H-Evs较N-Evs更能促进PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1水平。说明低氧提高了ADSCs-Evs对CMECs的增殖、迁移、血管生成和自噬能力；3-MA可逆转H-Evs对PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达的作用。说明缺氧微环境诱导下的ADSCs-Evs通过增加LC3B表达对人微血管内皮细胞发挥保护作用。

综上所述，低氧微环境诱导下的ADSCs-Evs通过增加LC3B表达促进OGD/R损伤的CMECs的增殖、迁移、侵袭、血管形成和自噬能力。具体的作用机制需进一步深入研究，以期更好的应用于临床。

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（收稿日期：2023-02-27）

（本文编辑薛妮）

作者单位 福建医科大学附属福清市医院（福建福清" 350300）

通讯作者 翁羽蕙，E-mail：liuliang998866@163.com

引用信息 刘亮，林煜，林通，等.脂肪间充质干细胞外囊泡通过增加LC3B表达对人微血管内皮细胞损伤的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（14）：2559-2567.