一株丁酸梭菌的分离鉴定及生物学特性研究

摘 要：本试验通过厌氧培养法从健康鸡的新鲜粪便中分离筛选得到1株菌株，从形态学观察、生理生化试验和16S rDNA基因序列分析等方面对菌株进行鉴定，确定该菌株为丁酸梭菌。对其生物学特性进一步研究，发现该菌株能够产生乙酸、丁酸等挥发性脂肪酸，对产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等多种肠道致病菌均有一定的抑菌能力。综上所述，该菌株在生长、抗逆、产酸、抑菌方面表现较好，具有很好的应用价值。

关键词：丁酸梭菌；分离鉴定；生物学特性

中图分类号：S816.7 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2024）07-0009-09

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）又被称为丁酸梭状芽孢杆菌、酪酸梭菌，是一种菌体呈杆状或弯曲状、周身被鞭毛包围的专性厌氧的革兰氏阳性菌，隶属芽孢杆菌科（Bacillaceae）、梭菌属（Clostridium）[1]，广泛存在于动物消化道、粪便、土壤和各种发酵产物中[2-3]。

作为革兰氏阳性菌里特有的肠道益生菌，丁酸梭菌能够在动物消化道中分泌多种代谢产物，其中最主要的代谢产物丁酸，有助于维持动物肠道上皮细胞的完整性，促进肠上皮组织的发育[4–6]。此外，丁酸梭菌能够产生淀粉酶、蛋白酶等多种胞外酶以及核黄素、维生素K、B族维生素等，可有效增强肠道上皮细胞的功能，改善营养物质利用率，提高有益菌丰度，竞争性抑制有害菌的生长，维持肠道健康[7-8]。丁酸梭菌可形成具有极强耐受性的芽孢，因此对各种环境的适应能力较强[9-10]。

近年来，丁酸梭菌作为饲料添加剂在增强动物免疫功能、促进肠道健康、防治细菌性疾病等方面表现出积极作用，具有广阔的应用前景及开发潜力[11]。因此，为了进一步筛选优良的丁酸梭菌，本研究从健康鸡的新鲜粪便中分离出1株丁酸梭菌，通过形态学比较、生理生化试验、系统进化关系分析确定其物种和亲缘关系，并对菌株的生长、产酸及抑菌能力进行初步分析，为开发畜禽可用的优良丁酸梭菌饲料添加剂奠定基础。

1 "材料与方法

1.1 "试验材料与试剂

采集健康鸡的新鲜粪便，加入灭菌离心管中冷藏保存带回实验室，于-20 ℃冰箱中保存备用。

TSN培养基（用于丁酸梭菌的分离培养）：胰蛋白胨15.0 g、酵母浸粉5.0 g、大豆蛋白胨5.0 g、柠檬酸铁铵1.0 g、偏重亚硫酸钠1.0 g、琼脂20.0 g（制备固体培养基时添加），蒸馏水加至1 000 mL，pH调至7.6 ± 0.2，121 ℃高压灭菌15 min。

RCM培养基（用于丁酸梭菌的增菌培养）：蛋白胨10.0 g、牛肉浸粉10.0 g、葡萄糖5.0 g、酵母粉3.0 g、可溶性淀粉1.0 g、氯化钠5.0 g、醋酸钠3.0 g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g、琼脂20.0 g（制备固体培养基时添加），蒸馏水加至1 000 mL，pH调至6.8 ± 0.1，121 ℃高压灭菌15 min。

用于生理生化鉴定的木糖-明胶培养基、可溶性淀粉培养基、硝酸盐胨水培养基、SIM培养基、蜜二糖细菌微量生化鉴定管、松三糖细菌微量生化鉴定管购于青岛海博生物技术有限公司。

1.2 "丁酸梭菌的筛选及鉴定

1.2.1 "丁酸梭菌的筛选 "称取样品3 g，加入装有100 mL生理盐水的三角瓶中，振荡摇匀，静置10 min。取上清液10 mL加入到90 mL无菌水中，置于80 ℃下水浴加热10 min，杀死非芽孢菌。将上一步处理过的样品溶液移入厌氧操作台，用无菌水逐级稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共6个梯度，使用移液枪分别吸取100 μL于TSN固体培养基上，涂布均匀。每组设置3个平行。

待TSN固体培养基凝固后，将平板移入厌氧操作台的恒温箱内，在37 ℃下厌氧培养24 h，期间观察氧气指示剂是否变色。当菌落形成后，提取单菌落进行显微镜镜检，观察菌落的形态特征。从中挑取符合丁酸梭菌形态特征的单菌落，采用“三区划线法”接种于RCM固体培养基，连续培养3～5代，得到形态基本一致的纯菌落，命名为D-1，用于后续菌种鉴定。

1.2.2 "形态学鉴定 "在厌氧操作台内，将连续培养3～5代后的纯菌落D-1接种于RCM固体培养基和TSN固体培养基上，在37 ℃恒温箱内厌氧培养24 h，观察记录筛选菌株D-1在两种培养基上的菌落形态，同时进行革兰氏染色。

1.2.3 "生理生化鉴定 "参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[12]和《常见细菌系统鉴定手册》[13]中的细菌鉴定方法，对筛选菌株D-1进行相关生理生化鉴定，包括明胶液化试验、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、硫化氢试验、单糖分解试验。

1.2.4 "分子生物学鉴定 "在厌氧操作台内，将筛选菌株D-1按照5%的接种量接种于RCM液体培养基，移入厌氧操作台的恒温箱中，在37 ℃下厌氧培养24 h，连续培养2～3代。按照细菌基因组提取试剂盒（北京天根）说明书步骤提取筛选菌株DNA，然后对其进行16S rDNA PCR扩增。PCR扩增引物采用细菌通用引物组：27F：5'-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系采用25 μL体系，包含PCR Mixture 21 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL。PCR反应程序设置；94 ℃预变性5 min，94 ℃变性20 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR反应结束后，取PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性条带产物送至华大基因进行测序。将测序结果通过BLAST在GenBank核酸数据库中与已知序列进行比对分析，下载同源度最高的菌株进行系统发育分析。为了进一步确定筛选菌株D-1的亲缘关系，使用MEGA 11软件[14]对下载序列和目的序列进行多重序列比对，检测最佳模型，采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树，系统发育树分支可信度采用1 000次自展（Bootstrap）分析。

1.3 "菌株生物学特性

在厌氧操作台内，将筛选菌株D-1按照5%的接种量接种于RCM液体培养基，在37 ℃恒温箱中厌氧培养24 h。

1.3.1 "生长能力测定 "（1）OD值检测：培养24 h后，使用紫外分光光度计和pH计测定筛选菌株D-1培养液的生物量OD600值及pH值。每组设置3个平行。

（2）活菌数检测：培养24 h后，使用移液枪吸取1 mL D-1培养液，加入玻璃试管内，用无菌水稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共6个梯度。然后将不同稀释度的D-1培养液接种至TSN固体培养基，37 ℃恒温箱培养24 h，根据菌落数计算样品中丁酸梭菌活菌数。每组设置3个平行。

（3）芽孢率检测：培养24 h后，使用移液枪吸取1 mL D-1培养液，加入玻璃试管内，用无菌水稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共6个梯度。然后将玻璃试管放置于水浴锅中，保持80 ℃水浴加热10 min后，接种至TSN固体培养基，根据公式计算芽孢率：

芽孢率=芽孢数/活菌数×100%

每组设置3个平行。

1.3.2 "抗逆能力测定 "（1）耐高温检测：培养24 h后，使用移液枪吸取1 mL D-1培养液，加入玻璃试管内，用无菌水将稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共6个梯度。然后将玻璃试管放置于水浴锅中，保持85 ℃水浴加热10 min，分别于加热前、加热5 min时和加热10 min时取样，接种至TSN固体培养基，37 ℃厌氧培养24 h，根据菌落数计算存活率。每组设置3个平行。

（2）耐酸检测：培养24 h，使用移液枪按照1%的接种量吸取D-1培养液，接种于pH值分别为1.0、2.0、3.0的 PBS缓冲液内，在37 ℃恒温箱下厌氧培养，分别于0、1、2、3 h时取样，接种至TSN固体培养基，37 ℃厌氧培养24 h，根据菌落数计算存活率。每组设置3个平行。

1.3.3 "抑菌能力测定 "采用牛津杯法检测D-1菌株对4种不同肠道致病菌株的抑菌效果。使用移液枪吸取100 μL培养24 h后的培养液，分别注入已接种致病菌株（100 μL）的LB培养基上的牛津杯中，于37 ℃恒温箱中培养18 h，使用量尺测定不同培养基上的抑菌圈直径（mm）。

1.3.4 "产酸能力测定 "为了保证菌株活力，在厌氧操作台内，将培养24 h后的筛选菌株D-1继续按照5%的接种量接种于RCM液体培养基，在37 ℃下厌氧培养24 h，连续培养2～3代，然后将连续培养后的培养液以12 000 r/min离心处理10 min，获得上清液。采用高效液相色谱（HPLC）法测定离心后上清液中的丁酸含量。

色谱条件[15]如下：色谱柱为AgilentPolaris C18-A（4.6 mm×250 mm，5 µm），柱温为40 ℃，流动相为甲醇和0.1%磷酸，流速为1.0 mL/min，检测波长为20 nm，进样量为10 μL，重复进样2次。丁酸的保留时间为15.461 min，配置1.25～10.0 g/L正丁酸作为标准曲线。

2 "结果与分析

2.1 "筛选菌株的鉴定

2.1.1 "形态学鉴定结果 "将筛选菌株D-1分别接种于TSN固体培养基和RCM固体培养基，于37 ℃厌氧培养24 h后，可见筛选菌株在TSN固体培养基上形成的菌落与柠檬酸铁反应生成黑色的硫化铁（图1A）；在RCM固体培养基上形成的菌落形状为圆形，表面湿润有光泽，颜色为不透明乳白色（图1B）；革兰氏染色结果表明，筛选菌株D-1是革兰氏阳性菌，镜检发现菌体形态表现为直杆状、两端钝圆（图1C）。

2.1.2 "生理生化鉴定结果 "对筛选菌株D-1进行硝酸盐还原试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、吲哚试验、硫化氢试验、单糖分解试验，鉴定结果如表1。结果表明，筛选菌株生理生化特征均与丁酸梭菌的特征相符，初步判断该分离菌为丁酸梭菌。

2.1.3 "分子生物学鉴定结果 "将筛选菌株D-1接种于RCM液体培养基，于37 ℃连续多代厌氧培养后，得到较高浓度的菌体培养液。将菌体培养液离心后取沉淀，提取16S rDNA进行PCR扩增。将扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳中进行DNA验证，发现在1 000～1 500 bp之间出现一条特异性条带（图2），与预期条带大小相符。

将扩增产物送至华大基因测序，得到筛选菌株D-1的16S rDNA序列。随后将获得的基因序列利用BLAST与GenBank核酸数据库中的已有序列进行比对分析，发现筛选菌株D-1与梭状芽孢杆菌属（Clostridium）的丁酸梭状芽孢杆菌序列相似性最高，为99.85%。为进一步确定筛选菌株的亲缘关系，利用MEGA 11软件对筛选菌种构建系统发育树（图3），发现筛选菌株D-1与丁酸梭状芽孢杆菌的亲缘关系最近，同时结合菌株形态和生理生化试验可以确定筛选菌株D-1为丁酸梭状芽孢杆菌，即丁酸梭菌。

2.2 "筛选菌株的生物学特性

2.2.1 "生长能力测定结果 "由表2可知，筛选菌株D-1在37 ℃厌氧培养24 h后，OD600值为1.820，pH值为4.40，活菌数为4.3×108 CFU/mL，芽孢数为3.5×108 CFU/mL，芽孢率为81.4%。

2.2.2 "抗逆能力测定结果 "由图4可知，筛选菌株D-1在85 ℃处理5 min时存活率在95%以上，在85 ℃处理10 min时存活率在80%以上。

由图5可知，当筛选菌株D-1在pH值为3.0的酸性环境下培养3 h时，其存活率为85%以上；在pH值为2.0的高酸性环境下培养3 h时，其存活率为75%以上；在pH值为1.0的强酸性环境下培养3 h时，其存活率为60%以上。

2.2.3 "抑菌能力测定结果 "由表3可知，筛选菌株D-1对4种肠道致病菌株的抑菌圈直径在11～14 mm之间，表明筛选菌株对这4种肠道致病菌株均有一定的抑菌效果。

2.2.4 "产酸能力测定结果 "由图6和图7可知，筛选菌株D-1在接种后的0～4 h内，为菌株生长迟滞期，菌株生长速度缓慢，具体表现为菌液OD600值和pH值缓慢增长；4 h后菌株D-1进入对数生长期，此阶段菌株生长速度很快，细菌开始大量繁殖，具体表现为菌液OD600值和pH值迅速升高；12 h后菌株D-1进入稳定生长期，此阶段菌株生长速度趋于稳定，菌株数目基本保持不变，最终菌液OD600值稳定在1.8左右，pH值稳定在4.4左右。同时，筛选菌株D-1也会随着菌株生长而不断产生丁酸，丁酸产量与菌株数目呈正相关，最终稳定在2.0 g/L左右。结果表明，筛选菌株D-1会在培养过程中产生发酵产物丁酸，从而导致细菌培养液pH降低。

3 "讨论

3.1 "丁酸梭菌的筛选鉴定

丁酸梭菌是动物肠道微生态菌群的重要组成菌株之一，在促进动物生长发育、增强机体免疫力、抑制病原微生物繁殖等方面具有重要作用[4–10]。由于同源动物粪便内的益生菌能够作用于同源动物本身，相比其他来源的益生菌具有更高的益生价值[16]。因此，医学上将健康动物的粪便菌群移植到肠道菌群失调的同源动物体内，使后者肠道菌群恢复稳态，从而达到治疗肠道疾病的目的，这个转移粪便细菌的方法叫做“粪菌移植”[17]。因此，从健康动物粪便中分离筛选益生菌作为同源动物的菌种来源，对于开发相应的饲料添加剂产品具有重要意义。

本研究从健康鸡的新鲜粪便中分离出1株在形态上符合丁酸梭菌特征的菌株D-1，并进一步通过细菌形态学观察和生理生化分析对该菌株进行鉴定。但是，由于细菌种类繁多，传统的细菌鉴定方法仅能通过形态和特性进行初步鉴定，无法准确地鉴定出细菌的种属[18]。近年来，随着分子生物学的蓬勃发展，16S rDNA技术已经能够深入分析细菌的遗传特征，从而揭示细菌间亲缘关系的远近，最终实现细菌的准确种属鉴定[19]。因此，本研究在细菌形态学观察和生理生化分析的基础上，通过16S rDNA序列分析技术鉴定，最终确定筛选菌株D-1为丁酸梭状芽孢杆菌，即丁酸梭菌。

3.2 "抗逆能力分析

目前，丁酸梭菌作为饲料添加剂被广泛应用于畜牧业中。研究表明，饲料中添加丁酸能够提高机体免疫力，改善肠道形态和结构，抑制炎症反应[20–23]。但是，丁酸梭菌在工厂化制备成为饲料添加剂的过程中需要经过高温、高压的制粒过程；进入动物体内后，丁酸梭菌需先经过胃才会进入肠道发挥益生功能。这就要求丁酸梭菌微生态制剂不仅能耐受生产中的高温、高压，还能耐受胃的酸性环境[24]。本研究筛选得到的丁酸梭菌D-1在85 ℃的高温处理10 min时存活率在80%以上，在pH值为1.0的强酸处理3 h时存活率在60%以上，表明D-1既能承受饲料制作过程中的高温高压，也能顺利通过胃进入肠道发挥益生功能，有作为饲料添加剂的潜力。

此外，丁酸梭菌在使用过程中主要以活菌制剂状态存在，而丁酸梭菌的芽孢具有更强的环境耐受力，因此提高丁酸梭菌的芽孢生成率也是保证丁酸梭菌微生态制剂发挥作用的有效方法。本研究筛选得到的丁酸梭菌的生孢率为81.4%，可为后续提高丁酸梭菌在发酵过程中的菌体浓度以及芽孢生成率提供参考。

3.3 "益生能力分析

研究表明，丁酸梭菌的代谢产物中含有大量丁酸、乳酸等酸性物质，能够在肠道内制造局部酸性环境，促进双歧杆菌和乳杆菌等肠道益生菌增殖，抑制有害菌生长[25]。有研究表明，丁酸梭菌能够产生的细菌素、抗菌肽等物质，进一步抑制有害菌繁殖，维持肠道生态平衡[26]。本研究中的产酸试验表明，D-1的丁酸产量可达2.0 g/L，进一步验证其为丁酸梭菌。

此外，本研究分别采用牛津杯法和活菌计数法验证D-1的抑菌活性，结果表明D-1对包括大肠杆菌和沙门氏菌在内的多种肠道致病菌株均具有抑制作用。Yang等[27]发现饲喂丁酸梭菌的岭南黄肉鸡盲肠中的肠道致病菌数量明显降低，而乳酸杆菌和双歧杆菌等有益菌的数量则明显增加；贾丽楠等[28]同样发现丁酸梭菌能够对肉仔鸡肠道致病菌产生抑制作用。这些试验结果与D-1的抑菌试验结果相对应，表明D-1具有一定的益生作用。但是，能够引起动物肠道发生疾病的细菌还有很多，对于该筛选菌株能否抑制其他肠道病原菌的生长还有待进一步研究。

4 "结论

本研究从健康鸡的新鲜粪便中分离得到1株在形态学上与丁酸梭菌相似的菌株D-1，经生理生化和分子生物学鉴定确定为丁酸梭菌。生物学特性研究表明，该菌株具有较好的生长、抗逆、产酸及抑菌能力，有作为饲料添加剂的潜力。

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Isolation， Identification and Biological Characteristics of

Clostridium butyricum

ZHAI Kaixuan1 ， LI Jinxiang1， LENG Dunpeng1， ZANG Xueyun1， YU Pengbo2，

MIAO Yue1， QI Huidong1

（1. Qingdao Zhong Ren Animal Pharmaceutical， Co.， Ltd.，Qingdao "266300， China;

2. Mishan Animal Husbandry and Veterinary Workstation， Weihai "264200， China）

Abstract： "In this experiment， a strain was isolated from the fresh feces of healthy chickens by anaerobic culture， and identified as Clostridium butyricum by morphological observation， physiological and biochemical test and 16S rDNA gene sequence analysis. Further study on its biological characteristics showed that the strain could produce volatile fatty acids such as acetic acid and butyric acid， it has certain bacteriostatic activity against a wide range of intestinal pathogens， including Clostridium perfringens， Staphylococcus aureus， Salmonella and Escherichia coli. In summary， the screened strain had good performance in the growth， stress resistance， acid production， antibacterial performance is good， which has good application values.

Keywords：Clostridium butyricum; Isolation and identification; Biological characteristics