微生物菌剂添加对猪粪堆肥氮素转化的影响

摘要：为探索猪粪与水稻秸秆混合堆肥过程中贝莱斯芽孢杆菌LH-3对氨气减排及氮素保留的促进作用，研究设置接种LH-3菌剂的试验组与未接种菌剂的对照组，分析菌剂添加对堆肥腐熟及氮素转化的影响。结果显示：两组堆肥均能达到高温无害化处理标准，且LH-3菌剂的添加对堆体温度无显著影响；试验组较对照组提前5 d达到腐熟标准，且最终产品的种子发芽指数提升了21.56%，显示出更优的腐熟质量；堆肥过程中，添加LH-3菌剂减少了33.42%的氨气排放，并使最终产品的全氮含量增加了11.46%；LH-3菌剂在堆肥高温阶段显著提升了氨单加氧酶基因和羟胺氧化还原酶基因的丰度，从而提高了该阶段的硝化作用强度。总体而言，贝莱斯芽孢杆菌LH-3是一种能有效促进猪粪好氧堆肥腐熟的生物添加剂，可以减少堆肥过程中的氨气排放，并提高堆肥的全氮含量，从而提升堆肥产品整体质量。

关键词：猪粪堆肥；贝莱斯芽孢杆菌LH-3；氮素变化；微生物菌剂

中图分类号：S141.4 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2024）09-0049-05

Microbial Inoculum Influences Nitrogen Transformation During Pig Manure Composting

XIE Li-juan1，CHEN Wei1，WANG Zhen1，TANG Bing-xuan1，GUO Zhao-hui1，CHEN Ran-bing2，

YIN Hong-mei1，LIU Biao1

（1. Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC; 2. Hunan Provincial Product Evaluation Center，

Changsha 410000， PRC）

Abstract： This study aims to evaluate the effects of Bacillus velezensis LH-3 on ammonia emission and nitrogen retention during the aerobic composting process of pig manure with rice straw. A treatment group with the inoculation of LH-3 and a control group without strain inoculation were designed. The results showed that the compost in both groups met the high-temperature sanitization treatment standard， and the inoculation of LH-3 did not significantly alter the temperature of the compost pile. Notably， the LH-3 group completed the composting five days earlier than the control group. Moreover， the final product in the LH-3 group increased the seed germination index by 21.56% compared with that in the control group， demonstrating higher quality. Furthermore， LH-3 reduced the cumulative ammonia emission during the composting process by 33.42% and increased the total nitrogen in the final compost by 11.46%. In addition， LH-3 enhanced the abundance of the ammonia monooxygenase gene （amoA） and the hydroxylamine oxidoreductase gene （hao）， thereby strengthening nitrification during the high-temperature composting stage. In conclusion， B. velezensis LH-3 serves as an effective biological additive that promotes the aerobic composting of pig manure， reduces ammonia emissions， and enhances nitrogen retention and overall quality of the compost product.

Key words： pig manure composting; Bacillus velezensis LH-3; nitrogen transformation; microbial inculum

畜禽粪便好氧堆肥技术是一种经济环保的处理技术，不仅能对畜禽粪便进行无害化处理，还能实现农业废弃物的资源化再利用，因此在养殖场和有机肥厂得到了广泛应用[1-2]。好氧堆肥是通过微生物的代谢活动，对有机物进行分解，使其矿质化、腐殖化的过程。随着畜禽粪便中含氮有机物的分解转化，氮素损失是堆肥不可避免的问题[3]。堆肥中氮素损失的主要原因是氨气挥发，氨气挥发导致的损失占总氮损失的79%～94%[4]。氨气的大量释放不仅降低了堆肥产品中氮素的含量，影响其养分含量，还造成了空气污染。因此，如何减少堆肥氨气释放，提高堆肥氮素含量成为了科研人员的研究热点。

调整堆肥过程的初始碳氮比、pH值、水分含量及通气量等关键工艺参数，可以有效减少氨气的排放量[5]。然而，这些参数的优化需维持在特定范围内，以确保堆肥的正常腐熟过程不受影响。因此，尽管这些方法能够在一定程度上减少堆肥过程中的氮素损失，但其效率仍受到一定的限制。大量研究表明，利用堆肥添加剂可显著减少氨气的释放，根据理化性质可将添加剂分为物理添加剂、化学添加剂、微生物添加剂[4]。与不添加生物炭相比，家禽粪便堆肥中添加10%的生物炭，氨气释放总量可减少60%，堆肥终产物总氮含量可提高51%[6]。Jiang等[7]研究发现，在以猪粪和小麦秸秆为原料的堆肥中添加5.26%的过磷酸钙，较不添加过磷酸钙处理，其氨气释放量减少了89.83%，总氮含量提高了24%。然而，大部分物理、化学类添加剂价格昂贵，不可循环利用，长期使用还可能会影响土壤理化性质，不利于农作物生长。相比而言，微生物添加剂成本低，对环境影响更友好，因此微生物添加剂的应用逐渐成为堆肥工艺技术研究的重要内容。一些研究聚焦于堆肥除臭菌株的筛选及除臭工艺的研发，发现微生物除臭剂具有高效稳定的除臭作用，并能减少堆肥肥效损失[8-10]。Zhang等[5]研究显示，添加微生物菌剂对减少堆肥氮素损失的效果不及物理、化学类添加剂，因此，急需筛选降氨保氮效果更优的微生物菌种资源。

硝化微生物在堆肥过程中能够将铵态氮有效氧化为硝态氮，显著降低铵态氮的浓度，进而有效减少堆肥过程中氨气的排放量[4-5]。因此，研究考虑将具有硝化能力的菌株作为微生物添加剂进行堆肥降氨保氮技术的研究。在前期研究中，课题组分离筛选到1株具有硝化能力的贝莱斯芽孢杆菌LH-3。该研究拟以LH-3菌株为材料，探讨在猪粪堆肥过程中添加微生物菌剂对堆肥产品氮素含量的影响，以期为畜禽粪便堆肥过程中氨气的减排和氮素的保留提供微生物资源和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

堆肥原料为猪粪和水稻秸秆，猪粪取自湖南湘潭某生猪养殖场，水稻秸秆取自附近农场，使用前切成2～3 cm小段，原料的基本理化性质如表1所示。贝莱斯芽孢杆菌LH-3为实验室前期研究分离所得，经液体发酵培养后，调节发酵液活菌数至1.0×109 CFU/mL备用。

1.2 试验设计

堆肥试验于2023年9月在110 L的模拟堆肥反应器[11]中进行，周期为25 d。将猪粪和水稻秸秆按鲜重质量比为4∶1的比例均匀混合，调节堆体的初始碳氮比至25∶1，调节初始含水量至60%。试验设置2个不同处理，对照组不接种外源菌剂；试验组接种5%（体积质量比）LH-3菌株发酵液，每个处理重复3次。保持堆肥通风速率为0.2 L/min，试验周期的前15 d每天翻堆物料30 min，后10 d每隔5 d翻堆物料30 min。分别于堆肥当天和堆肥后5、10、15、20、25 d取样。每个样品分为2份，1份于4℃保存，用于测定理化参数；1份冷冻干燥后于-80℃保存，用于样品中功能基因的定量分析。

1.3 检测分析

1.3.1 温度和种子发芽指数检测 每天上午10：00通过堆肥反应器的温度传感器测定各处理堆体的温度。参照NY/T 525—2021标准测定种子发芽指数（GI）。称取10 g堆肥鲜样，加入100 mL蒸馏水，150 r/min振荡1 h后静置30 min；使用滤纸过滤，取8 mL滤液加入到铺有双层滤纸的培养皿中，每个培养皿中均匀放置10粒萝卜种子，25℃避光培养48 h；测量各培养皿中种子发芽后的根长，计算种子发芽率，根据公式（1）计算种子发芽指数。

（1）

1.3.2 氨气释放量和全氮含量检测 利用硼酸溶液吸收堆肥过程产生的氨气，用0.1 mol/L标准硫酸溶液滴定，根据所消耗的硫酸溶液计算氨气的释放量。参照NY/T 525—2021标准测定全氮含量。称取约0.6 g风干后的堆肥样品，加入5 mL浓硫酸和2 mL过氧化氢浸泡过夜后，高温加热至硫酸冒烟时，冷却补充过氧化氢溶液，直至溶液呈无色或淡黄色；利用凯氏定氮仪将消解后溶液中的铵态氮蒸馏出来，用硼酸溶液吸收，以标准盐酸溶液滴定，再计算样品的全氮含量。

1.3.3 硝化功能基因丰度的定量分析 通过实时荧光定量PCR对氨单加氧酶基因（amoA）和羟胺氧化还原酶基因（hao）进行绝对定量分析。将堆肥初始（0 d）、高温期（5、10 d）、降温期（15 d）、腐熟期（25 d）的样品冷冻干燥后，提取基因组DNA，通过荧光定量PCR进行定量分析。amoA扩增正向引物和反向引物分别为5'-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3'、5'-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3'，hao扩增正向引物和反向引物分别为5'-TCAACATAGGCACGGTT

CATCGGA-3'、5'-ATTTGCCGAACGTGAATCGGAA

CG-3'。qPCR反应体系（10 µL）：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 5 µL，正反向引物各0.4 µL，50×ROX Reference Dye 0.2 µL，双蒸H2O 3 µL，模板DNA 1 µL。PCR反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性5 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，40个循环。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2007进行数据处理和图形绘制，使用SPSS 25.0软件进行单因素方差统计分析。

2 结果与分析

2.1 堆肥温度和种子发芽指数变化

堆肥温度直观反映了堆肥的进程，是衡量堆肥无害化的重要指标。根据图1可知，对照组和试验组的堆体温度呈现相同的变化趋势，均经历了升温期、高温期、降温期、腐熟期。对照组、试验组均在堆肥第3天达到高温期（＞50℃），堆肥最高温分别为59.1、59.7 ℃，高温期维持时间分别为9、10 d，均达到GB/T 36195—2018标准的要求。在整个堆肥过程中，对照组与试验组的温度无明显差异，说明堆肥原料中含有足够数量的土著微生物，微生物生长繁殖过程中产生的热量可以维持堆体的高温。

种子发芽指数是评价堆肥腐熟度的重要生物学指标，根据NY/T 525—2021标准可知，当GI≥70%时，认为堆肥产品达到腐熟水平，对植物无明显毒害作用。由图2可知，随着堆肥进行，各堆体浸提液处理的种子发芽指数不断升高，植物毒性逐渐降低。对照组和试验组堆体浸提液处理的种子发芽指数分别在堆肥后20、15 d时达到70%以上，且堆肥结束时，两组堆体的种子发芽指数分别为95.1%、115.6%，说明菌剂LH-3的添加缩短了堆肥腐熟的周期，提升了堆肥的腐熟度。

2.2 氨气释放量和全氮含量变化

堆肥过程中各时期氨气释放量及整个堆肥周期累积量如图3所示。氨气排放主要集中在高温期，后期随着温度的降低，氨气的释放量显著减少。在堆肥高温期，试验组的氨气释放量显著低于对照组；整个堆肥周期对照组和试验组氨气累积释放量分别为19.21、12.79 g，菌剂添加减少了33.42%的氨气排放。

氮是植物生长与代谢最重要的营养元素之一，氮素含量是衡量堆肥产品品质的重要指标。由图4可知，对照组和试验组堆体的全氮含量在整个堆肥周期表现出相同的变化趋势，全氮含量在堆肥前期降低，中期升高，后期基本保持稳定。堆肥结束时，试验组的全氮含量提升至2.14%，相较于对照组的1.92%，增幅达到了11.46%。这表明适量接种菌剂LH-3能有效促进猪粪和水稻秸秆堆肥过程中氮素营养的积累与保留，从而提升堆肥产品的氮素含量。

2.3 硝化功能基因丰度变化

amoA基因编码的氨单加氧酶和hao基因编码的羟胺氧化还原酶是催化铵态氮转化为亚硝态氮的两种关键酶。图5结果显示，各组堆肥后期amoA基因和hao基因的丰度均明显高于堆肥初始期、高温期的丰度，原因可能是堆体中的硝化微生物对温度敏感，堆体高温会抑制其生长繁殖[12]。

在初始堆肥阶段，对照组与试验组的amoA基因丰度水平相似；堆肥进行至第5天和第10天时，试验组的amoA基因丰度显著高于对照组；进入堆肥的降温-腐熟阶段后，两组的amoA基因丰度差异不显著。两组的hao基因丰度在堆肥前期和后期无显著性差异，而在堆肥第10天和第15天时，试验组的hao基因显著高于对照组。以上结果表明，菌剂LH-3可以显著提高堆肥高温期-降温期的amoA和hao基因丰度，从而增强该阶段硝化作用的强度，促进铵态氮向亚硝态氮的转化，从而降低堆体铵态氮浓度，减少氨气的释放。

3 讨论与结论

通过接种外源微生物菌剂改变堆肥氮素转化是一种低成本、易操作的减少堆肥氮素损失的方法[4]。Chen等[9]在鸡粪与小麦秸秆混合堆肥中添加10%的特定微生物菌群CMMC，有效降低了21.8%的氨气排放量。该研究中LH-3菌剂添加组堆肥氨气排放量减少了33.42%，展现出了更优的氨气减排性能。与其他研究类似，堆肥期间氨气释放主要集中在高温期，这是因为堆肥初期氨化微生物代谢活跃，将有机氮分解产生大量的铵态氮，在堆体高温和高pH值环境下，氨气大量逸出[13]；堆肥后期随着有机氮的消耗，铵态氮的产生量越来越少，同时后期硝化作用强度增加，铵态氮转化为硝态氮速率增大，因此氨气释放量显著减少。

硝化微生物在堆肥过程可以显著减少氨气释放，然而值得注意的是，这些微生物的引入可能会加剧堆体内的反硝化作用，促使硝酸盐等形态的氮转化为N2O、NO等气体，导致堆肥中的氮素含量下降。鉴于此，为了全面评估微生物菌剂在降低氨气释放与保持氮素含量方面的平衡能力，研究对堆肥的全氮含量进行了分析。该研究中，两组堆体全氮含量变化趋势相似，前期全氮含量不断减少是高温期氨气的大量释放导致的，中期物料大量降解消耗，并且其消耗速率大于氮素损失的速率，导致出现了相对浓缩效应[14]，因此全氮含量不断增加。

堆肥中硝化作用是由微生物介导的生物氧化过程，包括氨态氮转变为亚硝态氮和亚硝态氮转变为硝态氮两个阶段。其中第一阶段是硝化作用的限速环节，该阶段分为两步，首先铵态氮在氨单加氧酶（由amoA基因编码）的催化作用下转变为羟胺，接着羟胺在羟胺氧化还原酶（由hao基因编码）的催化作用下氧化为亚硝态氮[15]。因此，堆体中amoA基因和hao基因的丰度在一定程度上能够反应堆肥硝化作用的强度。堆肥第5天和第10天试验组的amoA基因丰度显著高于对照组，堆肥第10天和第15天试验组的hao基因显著高于对照组，表明菌剂LH-3可以显著提高堆肥高温期-降温期硝化作用的强度，减少氨气的释放。

综上所述，在猪粪与水稻秸秆混合堆肥中接种贝莱斯芽孢杆菌LH-3，可以加速堆肥的腐熟进程，提升最终产品的腐熟度，减少堆肥氨气排放量，提高肥料的全氮含量。关键硝化功能基因的定量分析揭示了LH-3菌剂的作用机制：在堆肥高温阶段，该菌剂显著提高了amoA和hao基因的丰度，提高了堆体内的硝化反应强度，有效降低了高温时期铵态氮的含量，进而从源头上减少了氨气的释放。

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（责任编辑：王婷）