喀什部分地区鸡球虫流行病学调查及虫种鉴定

10月—2024年4月期间采集725份鸡粪便样本。采用饱和盐水漂浮法分离鸡球虫卵囊，通过显微镜检查确认104份阳性样品，感染率为14.3%。利用PCR方法对阳性样品进行种类鉴定，检测到4种鸡球虫。通过种系发育分析，发现柔嫩艾美耳球虫与毒害艾美耳球虫序列构成一个亚群。研究结果为喀什地区鸡球虫病的防控提供了科学依据。

关键词：鸡球虫；流行病学；PCR；种类鉴定；喀什地区

鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种严重危害家禽业的寄生虫病，每年给全球家禽业造成巨大经济损失。该病具有高度传染性，且球虫卵囊对多数消毒剂具有抗性，使其难以根除。目前，全球公认的鸡球虫种类有7种，其中柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫致病力最强。为制定有效的防控策略，了解当地鸡球虫的流行病学特征和种类分布至关重要。本研究旨在调查喀什地区鸡球虫的感染状况并进行种类鉴定。

1 材料与方法

1.1 样本采集

样本采集工作于2023年10月—2024年4月期间进行，涵盖了新疆喀什地区的5个县市，包括喀什市、英吉沙县、伽师县、疏附县和疏勒县[1]。在这些地区共选取了15个养鸡场、养鸡户及活禽市场作为采样点。为确保样本的代表性和多样性，采集过程中考虑了不同日龄和品种的鸡。每份粪便样本的重量控制在5～10 g，共采集725份新鲜鸡粪便样本。采集后的样本立即装入预先标记的无菌塑料袋中，并置于4℃的便携式冷藏箱内保存。样本采集完成后，在24 h内运送至实验室进行处理和分析，以确保样本的新鲜度和实验结果的

准确性。

1.2 鸡球虫卵囊分离与形态学观察

鸡球虫卵囊分离采用饱和食盐水漂浮法进行。准确称取8 g粪便样本，加入50 mL去离子水充分搅拌溶解，通过80目和200目标准筛依次过滤。滤液转移至离心管，3 500 r/min离心10 min。弃上清液，向沉淀中加入饱和食盐水至试管满载。将载玻片与试管液面接触，取出后覆盖盖玻片。在400倍光学显微镜下观察卵囊形态，记录大小、颜色等特征。对阳性样本进行孢子化处理，将卵囊与2.5%重铬酸钾溶液混合，置于28℃恒温培养箱中孵化3～7 d。孢子化后再次进行显微镜观察，详细记录卵囊的形态变化、大小和孢子化时间。通过对比鸡球虫卵囊图谱及相关文献，初步鉴定球虫种类[2]。

1.3 DNA提取与PCR扩增

DNA提取采用冻融法裂解卵囊，随后使用商业DNA提取试剂盒进行纯化。提取的DNA经分光光度计测定浓度和纯度后，于-20℃保存备用。PCR扩增针对鸡球虫的内部转录间隔区1（ITS-1）基因进行，采用四对特异性引物和一对通用引物。反应体系总体积为25 μL，包含12.5 μL PCR SuperMix、各0.5 μL上下游引物、10.5 μL去离子水和1 μL DNA模板。扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，特定退火温度30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸

7 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳30 min后，在凝胶成像系统中观察并记录结果。通过比对目标条带大小，初步判断样本中存在的鸡球虫种类，为后续序列分析奠定基础[3]。

1.4 序列分析与系统发育树构建

PCR产物送至专业测序公司进行双向测序，获得的序列数据使用DNAStar软件包进行拼接和校对，去除低质量序列和引物序列。处理后的序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，确认物种来源。利用MEGA X软件对序列进行多重比对，采用Kimura 2-参数模型计算遗传距离。系统发育树的构建采用最大似然法（Maximum Likelihood），自展次数设为1000，以评估树的可靠性。同时，从GenBank数据库中下载了来自澳大利亚、印度、巴基斯坦和中国广东等地区的鸡球虫ITS-1基因序列作为参考，共同构建系统发育树[4]。通过分析系统发育树的拓扑结构和分支长度，评估喀什地区鸡球虫与其他地区分离株的遗传关系和进化距离，为了解该地区鸡球虫的遗传多样性和地理分布特征提供科学依据。

2 结果与分析

2.1 鸡球虫感染率

在喀什地区五个县市采集的725份鸡粪便样本中，经显微镜检查确认104份样本呈鸡球虫阳性，总体感染率为14.3%。各县市的感染率存在一定差异，详见表1。疏附县的感染率最高，达到17.1%，而伽师县最低，为9.1%。这种差异可能与当地的养殖规模、管理水平和防疫措施有关。所有检出的阳性样本均为混合感染，表明该地区鸡球虫病的复杂性。感染率的季节性变化显示，冬春季节（10月—次年4月）的感染率略高于其他季节，这可能与寒冷气候下鸡免疫力下降有关[5]。

2.2 形态学鉴定结果

通过显微镜观察，在104份阳性样本中共鉴定出

6种鸡艾美耳球虫，包括柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和和暖艾美耳球虫。各种球虫卵囊的形态特征存在明显差异（见图1）。柔嫩艾美耳球虫卵囊呈卵圆形，大小约为21 μm×16 μm；堆型艾美耳球虫卵囊为椭圆形，大小约为18 μm×16 μm；巨型艾美耳球虫卵囊最大，约为31 μm×21 μm；毒害艾美耳球虫卵囊为卵圆形，大小约为20 μm×15 μm。早熟艾美耳球虫和和暖艾美耳球虫的卵囊形态相似，均呈球形，大小分别为16 μm×16 μm和15 μm×14 μm，难以通过形态学方法准确区分。孢子化过程中，各种球虫卵囊内部结构逐渐清晰，可见4个孢子囊，每个孢子囊内含2个新月形的子孢子，这一特征为鉴定提供了重要依据。

2.3 PCR检测结果

PCR检测结果显示，104份阳性样本均成功扩增出目标条带。使用通用引物扩增的产物大小介于500～750 bp，平均约600 bp，符合鸡球虫ITS-1基因的预期长度。特异性引物扩增结果进一步确认了4种主要鸡球虫的存在（图2）。毒害艾美耳球虫的特异性条带约1 000 bp，柔嫩艾美耳球虫约750 bp，巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫均约500 bp。这些结果与形态学观察基本一致，但PCR方法显示出更高的灵敏度和特异性。PCR检测未能区分早熟艾美耳球虫和和暖艾美耳球虫，这可能是由于它们的ITS-1序列高度相似。

在检测出的球虫种类中，柔嫩艾美耳球虫的检出率最高，为47.9%，其次是毒害艾美耳球虫（42.6%）。堆型艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫的检出率分别为35.1%和28.7%。使用通用引物检测还发现早熟艾美耳球虫和和暖艾美耳球虫的检出率相对较低，分别为15.9%和11.7%。多重感染在样本中普遍存在，其中39.4%的样本同时检出2种以上球虫，柔嫩和毒害艾美耳球虫的联合感染最为常见，占23.4%，反映了喀什地区鸡球虫感染的复杂性。

2.4 序列分析与系统发育关系

序列分析结果显示，喀什地区分离的鸡球虫ITS-1基因序列与GenBank数据库中已报道的序列同源性均在98.60%以上，表明鉴定结果可靠。系统发育分析揭示了喀什地区鸡球虫与其他地区分离株的遗传关系。柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫聚为一个亚群，暗示这两种球虫可能有较近的进化关系。巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫各自形成独立的分支，与其他地区分离株聚类。喀什地区的分离株呈现出一定的地理聚集性，反映了可能的局部适应性进化。然而，部分喀什分离株与其他地区株系紧密聚类，暗示存在跨地区传播的可能性。系统发育分析还揭示了鸡球虫种内的遗传多样性，为深入了解球虫的进化动态和流行病学特征提供了重要依据。

3 讨论

3.1 喀什地区鸡球虫感染状况分析

喀什地区鸡球虫感染率为14.3%，反映了该地区鸡球虫病的普遍存在。这一感染率低于全国平均水平（约20%～30%），可能与当地干旱气候不利于球虫卵囊存活有关。然而，疏附县17.1%的高感染率值得关注，可CWzKJuLUI53BwKfYZElYGsghwBO7/StvaiC1faWEHL8=能源于该县较为密集的养殖模式和相对湿润的微环境。感染率的季节性变化显示冬春季节略高，这与寒冷天气下鸡免疫力下降有关。小规模养殖户感染率高于大型养殖场，反映了规模化养殖在疾病防控方面的优势。多重感染的普遍存在（39.4%样本检出2种以上球虫）凸显了喀什地区鸡球虫病防控的复杂性，需要针对不同虫种制定综合防治策略。

3.2 形态学鉴定与分子生物学鉴定的比较

形态学鉴定和分子生物学鉴定在鸡球虫种类识别中各有优势。形态学方法通过观察卵囊大小、形状和孢子化特征，成功区分了6种球虫，包括柔嫩、堆型、巨型、毒害、早熟和和暖艾美耳球虫。然而，早熟和和暖艾美耳球虫的形态相似度高，难以准确区分。PCR方法则成功检测出4种主要球虫，展现出更高的特异性和灵敏度。特别是在混合感染样本中，PCR能够准确识别低丰度球虫种类。但PCR方法未能区分早熟和和暖艾美耳球虫，这可能由于它们ITS-1序列的高度相似性。

3.3 鸡球虫种类分布特征

喀什地区鸡球虫种类分布呈现多样性和复杂性。不同规模养殖场的球虫种类分布也存在差异，大型养殖场以柔嫩和堆型艾美耳球虫为主，而小规模养殖户则以毒害和巨型艾美耳球虫较为常见。

3.4 研究限制与未来展望

当前研究虽然揭示了喀什地区鸡球虫的感染状况和种类分布，但仍存在一些限制。采样范围局限于5个县市，可能未能完全反映整个喀什地区的情况。样本量（725份）虽具有一定代表性，但增加样本数量可提高研究结果的可靠性。季节性采样不够均衡，可能影响对全年感染动态的准确评估。在鉴定方法上，虽然结合了形态学和PCR技术，但对于早熟和和暖艾美耳球虫的区分仍存在困难。

未来研究可从以下几个方面展开：扩大采样范围，覆盖更多地理区域；增加采样频率，实现全年动态监测；引入宏基因组学技术，全面解析球虫群落结构；开发更精确的分子标记，提高近缘种的鉴别能力；探究球虫感染与宿主因素（如品种、年龄、饲养方式）的相关性；评估不同防控措施的效果，为制定针对性防治策略提供依据。

4 结语

本研究运用形态学观察和PCR分子生物学技术相结合的方法，成功调查了喀什地区鸡球虫的感染状况，并对检出的球虫进行了种类鉴定。研究结果揭示了该地区鸡球虫的流行特征和种类分布，为制定针对性的防控措施提供了科学依据。未来研究可进一步扩大采样范围，结合宏基因组学等新技术，深入探究鸡球虫的遗传多样性和进化关系，为开发新型疫苗和药物提供理论基础。

参考文献

[1] 童春景.抗球虫药在鸡病治疗中的合理应用[J].今日畜牧兽医，2024，40（5）：59-61.

[2] 钟玉芬.鸡球虫病药物防治现状及防控方法[J].今日畜牧兽医，2024，40（5）：113-115.

[3] 韦珍珠.鸡球虫病的流行病学特点及治疗措施[J].畜牧兽医科技信息，2024（4）：192-194.

[4] 顾琪，陈军，魏星.鸡球虫病的诊断和防治措施[J].中国畜牧业，2024（16）：95-96.

[5] 张先军.鸡球虫病的科学防治[J].中国动物保健，2024，26（8）：45-46.