SPHK1靶向NF-κB信号通路调控胃癌细胞的迁移与侵袭

关键词：胃癌；鞘氨醇激酶-1；NF-κB；迁移；侵袭

胃癌（GC）是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一［1］。据调查，GC在全球发病率呈逐年递增趋势［2］。其发病率和死亡率在中国所有癌症类型中排名第3，占全球GC新发病例和相关死亡病例的44.0%和48.6%［3］。GC患者多采用手术治疗、放化疗以及免疫治疗，但临床疗效及预后不佳［4，5］。高侵袭与转移性能力是肿瘤保持恶性的重要特征。然而到目前为止，导致癌症转移的复杂机制还远远没有被完全理解。因此，为明确GC转移机制急需寻找潜在的治疗靶点。

鞘氨醇激酶1（SPHK1）是一种保守的脂质激酶，可将鞘氨醇磷酸化进而生成鞘氨醇-1-磷酸，已被发现在肿瘤进展不同阶段中发挥着各种功能［6］。SPHK1 是SPHK家族蛋白中的一员，是介导细胞各个方面的关键信号分子，并在多种致癌过程中发挥核心作用，包括细胞增殖、迁移与侵袭［7， 8］。据研究，SPHK1是结直肠癌细胞中的激活因子，通过调控特定信号通路表达来促进癌症发生发展［9-11］。在胰腺癌组织中，SPHK1表达上升，并通过分析患者ROC 曲线表明低生存率与高表达的SPHK1密切相关［12］。SPHK1在非小细胞肺癌组织和细胞系中表达上调。过表达SPHK1增加了癌细胞的增殖和迁移能力［13］。核因子-κB（NF-κB）是转录因子家族中的一员，是免疫、炎症和癌症的关键调节因子［14］。抑制鼻咽癌细胞中NF-κB信号转导作用，可大大降低靶基因对癌细胞的增殖、侵袭能力［15］。同时，NF-κB通路的激活增加了卵巢癌中TRIM52对肿瘤介导的恶性行为［16］。然而，尚不清楚SPHK1 是否与GC恶性进展过程中的NF-κB信号通路有关，因而需要对SPHK1 进行深入探究。本研究旨在利用生物数据库与体内外实验分析SPHK1在GC发生发展中的作用及其潜在的通路分子机制，从而为GC治疗带来新方向。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 患者样本 选取2023年6月～12月在蚌埠医科大学第一附属医院胃肠外科行手术切除的GC患者40例（男28例，女12例，年龄35～75岁），经患者术前书面知情同意后获得该40 例患者的非癌性胃组织样本（术中病理切片结果证实为正常组织）纳入本研究。从医疗记录中检索患者临床特征，包括性别、年龄、肿瘤大小和肿瘤分期等（表1）。本研究经蚌埠医科大学伦理委员会批准［伦理批号： 第（2023）311，（2023）405号］。

1.1.2 主要试剂 PDTC（MCE）；RPMI 1640培养基、胰酶、胎牛血清（Gibco）；小鼠多克隆抗体SPHK1、P65、p-P65、p-PI3K、MKI67 以及单克隆抗体GAPDH、PI3K、VEGFA、IL-17（ Proteintech）；总RNA提取试剂盒、逆转录、定量PCR试剂盒（Novoprotein）。引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司。慢病毒合成于上海吉玛制药技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 公共数据库检索 TIMER2.0 （http：//timer.cistrome. org）数据库分析SPHK1 在泛癌中的表达。GEPIA（http：//gepia. cancer-pku.cn）数据库搜索SPHK1相关基因表达及关联。HPA（https：//www.proteinatlas.org）数据库检索SPHK1与MKI67的IHC结果。Kaplan-Meier plotter（https：//kmplot.com）数据库预测GC患者预后。cBioportal（https：//www.cbioportal.org）数据库下载与SPHK1在GC中共表达的前500个潜在靶基因。DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）数据库分析检索生物富集通路。微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）网站在线编辑处理下载数据并产生气泡图。KEGG（https：//www. kegg.jp）数据库检索相关信号通路。

1.2.2 免疫组织化学（IHC） IHC检测组织中SPHK1与MKI67的表达。临床40例GC组织和40例匹配的非癌性组织按照标准程序进行操作。具体步骤如固定、脱水、包埋、制片、染色等，经一抗（SPHK1/1∶200，MKI67/1∶2000）、二抗（山羊抗兔ZSGB-BIO/1∶3000）孵育后进行DAB染色，然后显色并采集图片评分。所有切片由2名病理科医师独立进行盲审评分。同样染色操作评分可参考张浩等［17］的研究。

1.2.3 细胞培养 人GC细胞株MGC-803、AGS、MKN-1、HGC-27 与正常胃上皮细胞GES-1 均购自中国科学院上海生命科学研究院，均在RPMI 1640完全培养液中于37 ℃、5%CO2的恒温细胞培养箱中培养，待细胞生长至合适密度时消化传代。

1.2.4 Western blotting 提取细胞蛋白并进行浓度测定。取等量的蛋白样品进行电泳，电泳完成后将蛋白凝胶转移至0.45 μm的PVDF膜上进行转膜。结束后将其浸入封闭液中封闭60 min。3次洗膜后，加入稀释相应一抗并在４℃冰箱中过夜孵育。次日洗膜，与二抗稀释室温摇床孵育90 min。洗膜后检测PVDF膜上的蛋白印迹信号。

1.2.5 qRT-PCR 提取细胞RNA并测定浓度和纯度，将其逆转录为cDNA。将得到的cDNA以GAPDH为内参，按照试剂盒操作方法进行qRT-PCR，检测目的基因表达情况。采用相对定量的方法（2-ΔΔCT） 计算基因的mRNA表达水平。相应引物序列如下：SPHK1引物上游：5'-TGGCATCTGCTGAACTCATTT-3'；下游：5'-TGCAGCGAGGTCTAATTGTTT-3'；GAPDH 引物上游：5'-GAGAAGTATGACA CAGCCTCAA-3'；下游：5'-GCCATCACGCCTG ACA GTTT-3'。

1.2.6 SPHK1 的RNA干扰和过表达 将人GC细胞系HGC-27与MGC-803进行铺板，当培养密度达到70%～80%，然后分别采用SPHK1 干扰（载体：GV382）、过表达（载体：GV492）和对照慢病毒载体对上述细胞进行敲低与过表达转染，6 h 后更换含培养基，3 d 后用含1 μg/mL嘌呤霉素的培养基筛选稳定表达细胞株。针对SPHK1慢病毒转染序列如表2。

1.2.7 细胞划痕实验 调整细胞密度为2.0×106/孔后铺板于6 孔板中，待显微镜下观察细胞融合成单层状态时，用无菌200 μL枪头在孔内垂直均匀划线，继续置于培养箱中培养。在0、24 h 时通过倒置显微镜（放大倍数×40）观察并随机分5 个区域拍照，得到的图片通过Image J 软件进行处理并计算划痕迁移率。

1.2.8 Transwell 迁移和侵袭实验 将悬浮于0.2 mL的无血清培养基中的稳转株细胞置于Transwell板的上孔（1×104/孔），将含有0.6 mL 的完全培养基装入下孔。37 ℃培养24 h后，用棉签将上腔的细胞完全去除，将下腔的细胞用4%多聚甲醛固定，并用0.1%结晶紫染色。然后在倒置显微镜（放大倍数×200）上随机分5个区域拍照计数，取平均值。对于侵袭试验，实验过程与迁移试验相似，只是在细胞装载之前，Transwell上孔加入50 μL的基质胶并孵育1 h。

1.2.9 裸鼠背部成瘤模型 4～5周龄雌性裸鼠12只购自杭州子源实验动物科技有限公司，在SPF环境下饲养。将裸鼠随机分为4 组（n=3）：shNC 组、shSPHK1 组、oeNC组和oeSPHK1组。将构建稳转株或GC细胞200 μL（2×107/只）皮下注射于裸鼠背部。2周后，在麻醉（0.7%戊巴比妥钠）下，采用颈椎脱臼法处死小鼠。然后，切除异种移植肿瘤，拍照并称重。本研究经蚌埠医科大学动物伦理委员会批准（伦理批号：第［（2023）574］号）。

1.3 统计学处理

所有统计数据采用Prism 9.0（Graphpad Software）、ImageJ软件进行分析。数据以均数±标准差表示。采用单因素方差分析检验、两样本t检验。Plt;0.05为差异有统计学意义。所有实验均重复3次。

2 结果

2.1 SPHK1在GC组织中的表达

基于TIMER2.0 数据库，SPHK1 表达水平在15 种癌症类型中上调，在2种癌症类型中下调，其中在GC组织中表达（Plt;0.001，图1A）。利用GEPIA数据库，SPHK1与MKI67在GC组织（n=408）中的表达水平均高于正常组织（n=211）（Plt;0.05，图1B）。此外，两者表达水平呈正相关（Plt;0.001，图1C）。HPA数据库显示，GC组织中SPHK1与MKI67的染色程度上调（图1D、E）。

2.2 SPHK1表达与GC患者预后的关联

GC 患者中高表达的SPHK1 预示着较差的总生存期（OS，Plt;0.001，图2A）和进展后总生存期（PPS，Plt;0.001，图2B）以及更差的无复发生存期（RFS，Plt;0.001，图2C）。

2.3 GC组织中SPHK1表达的上调

IHC结果显示，SPHK1 与MKI67 在GC组织的阳性染色强度均高于非癌性胃组织（图3A）。GC组织切片中SPHK1 与MKI67 蛋白的综合染色评分也高于正常组织切片（Plt;0.001，图3B）。同时，两种蛋白相对表达量呈的正相关（Plt;0.0001，图3C）。此外，Western blotting与qRT-PCR结果显示，SPHK1 在HGC-27 细胞系中高表达，在MGC-803细胞系中低表达，差异有统计学意义（Plt;0.05，图3D、E）。

2.4 SPHK1对GC细胞迁移与侵袭的影响

Western blotting结果显示，shSPHK1组SPHK1的表达下调（Plt;0.001），而oeSPHK1组SPHK1的表达上调（Plt;0.01，图4A）。shSPHK1组MKI67蛋白表达受到抑制（Plt;0.01），而oeSPHK1 组的MKI67 蛋白表达上调（Plt;0.05，图4B）。此外，细胞划痕实验表明，与NC组相比，转染shSPHK1 的HGC-27 细胞在24 h 时，细胞的迁移率降低，转染oeSPHK1 的MGC-803 细胞在24 h时，细胞的迁移率增加，差异有统计学意义（Plt;0.01，图4C、E）。Transwell 侵袭实验显示，与NC 组相比，shSPHK1 组HGC-27 细胞的侵袭能力减弱，oeSPHK1 组MGC-803细胞的侵袭能力上调，差异有统计学意义（Plt;0.01，图4D、F）。此外，裸鼠成瘤实验显示，与NC组相比，shSPHK1组肿瘤大小和质量减小，而oeSPHK1组增加，差异有统计学意义（Plt;0.001，图4G、H）。

2.5 SPHK1靶向NF-κB信号通路

基于cBioportal 数据库下载与SPHK1 在GC中共表达的前500个潜在靶基因，DAVID数据库分析潜在靶基因并下载SPHK1mRNA富集相关数据，利用微生信网站处理并得出SPHK1相关潜在靶基因参与GC生物过程、细胞组成与分子功能中的细胞黏附、迁移及血管生成等（Plt;0.05，图5A）。KEGG通路显示NF-κB、PI3K富集其中（Plt;0.05，图5B）。与NC组相比，shSPHK1组抑制了磷酸化P65（p-P65）与PI3K（p-PI3K）水平，而总蛋白P65、PI3K无明显变化。VEGFA与IL-17表达水平也受到抑制（Plt;0.05，图5C、E）。相反，SPHK1过表达则增强了这一表现（Plt;0.05，图5D、F）。

2.6 阻断NF-κB信号通路，SPHK1对GC细胞的迁移与侵袭能力的影响

利用PDTC（NF-κB信号通路抑制剂）处理前期已构建的病毒稳转株细胞24 h。Transwell迁移与侵袭实验结果显示，与shSPHK1+DMSO组相比，shSPHK1+PDTC组的细胞迁移与侵袭能力下调（Plt;0.05，图6A）。与oeSPHK1+DMSO组相比，oeSPHK1+PDTC组的细胞迁移与侵袭能力也下调（Plt;0.05，图6B）。同样，p-P65、VEGFA和IL-17蛋白水平变化中，shSPHK1+PDTC组、oeSPHK1+PDTC组与对照组相比，其表达量下降，差异有统计学意义（Plt;0.05，图6C～F）。

3 讨论

鞘氨醇激酶家族蛋白参与多种癌症进展过程［18］，如S1PR1信号通过增强肿瘤细胞中趋化因子的表达来促进GC转移［19］。SPHK1通过刺激Akt/FoxO3a 信号传导下调凋亡蛋白表达来抵抗GC细胞凋亡［20］。SPHK2 在GC组织中表达上调，对GC发挥致癌作用［21， 22］。基于生物信息学分析，SPHK1在GC组织中的表达高于正常胃组织以及高表达的SPHK1预测更差的生存期。这与我们的研究结果一致，IHC结果显示SPHK1与MKI67在GC组织中表达上调且两者呈正相关。MKI67 是肿瘤细胞恶性增殖因子。随着MKI67 指标的建立，MKI67已发展成为癌症患者诊断和预后评估的标准［23］。以上数据提示SPHK1可能是GC进展中的恶性因子。

远处转移是GC患者高死亡率的原因之一［24］。肿瘤转移是一个多阶段的过程。肿瘤细胞的迁移和侵袭是转移过程中的关键环节［25］。SPHK1在乳腺癌［26］和前列腺癌［27］中已经证明了肿瘤细胞的迁移和侵袭功能。与上述研究结果类似，我们的数据显示敲低SPHK1抑制GC细胞的迁移和侵袭，而过表达SPHK1则相反。此外，裸鼠背部成瘤实验结果显示敲低SPHK1可抑制肿瘤的生长，而过表达SPHK1则会加速肿瘤生长。据此，我们的研究数据进一步证实了SPHK1在肿瘤进展中的重要作用。据报道，SPHK1 可激活多种癌症相关信号通路，如结直肠癌中的TRAF6/ULK1通路［28］、膀胱癌中的NONO/STAT3 通路［6］以及非小细胞肺癌的JAK/mTOR通路［13］。本课题主要研究集中在NF-κB通路，SPHK1对其它通路的影响将在我们未来的研究中深入挖掘。NF-κB信号通路在肿瘤相关活动中发挥重要作用，如细胞增殖、迁移与侵袭［29，30］。靶向调控SPHK1转录激活NF-κB/p65 磷酸化可促进结直癌进展［31］。基因代谢组学分析显示SPHK1通过NF-κB激活促进口腔鳞状细胞癌的生长与转移［32］。有研究发现，NF-κB/P65与GC恶性转移可能存在关联［33］。在本研究中，SPHK1激活了GC细胞中磷酸化NF-κB信号通路。利用PDTC（NF-κB通路抑制剂）［34， 35］干预SPHK1敲低和过表达细胞株，结果显示，抑制NF-κB信号通路后，SPHK1 减弱了对GC细胞迁移与侵袭的作用，表明NF-κB参与了SPHK1介导的GC细胞的迁移、侵袭，继而提示SPHK1可能调控NF-κB促进GC的转移。VEGFA是重要的血管生成因子，与GC侵袭、转移有关［36， 37］。IL-17与免疫细胞共同作用，促进肿瘤转移［38］。VEGFA、IL-17 可能是NF-κB信号通路的转录靶点［39］。本研究显示，敲低SPHK1下调了p-P65、VEGFA和IL-17，而过表达SPHK1 结果则相反。据此，我们推测SPHK1靶向NF-κB信号通路调节VEGFA/IL-17表达进而调控GC进展。然而本研究还存在一些不足之处：SPHK1 激活NF-κB通路与其他相互作用蛋白共同调控促进GC转移的机制还亟需进一步探索。在裸鼠成瘤模型中亦未进行深入验证SPHK1调控NF-κB通路的促癌作用。

综上所述，本研究表明SPHK1在GC中表达上调，同时靶向NF-κB信号通路促进GC细胞的增殖、迁移与侵袭，继而促进肿瘤的发生发展。因此，SPHK1可作为GC患者治疗过潜在新靶点。