gga-miR-130b-3p在鸡脂肪相关组织中的表达规律及其靶基因的生物信息学分析

摘要：为探究gga-miR-130b-3p对鸡脂肪沉积的作用，以江苏省家禽科学研究所自主培育的矮小品系S3系和引进的国外肉鸡品种隐性白羽鸡为试验素材，检测gga-miR-130b-3p在2个品种0日龄、2周龄、8周龄、14周龄、16周龄肝脏、腹脂、腿肌和肌内脂肪细胞中的表达变化，并对靶基因进行预测、分析。结果显示，0 W与 16 W 肝脏组织中gga-miR-130b-3p的表达水平存在明显品种差异，且在S3系鸡中gga-miR-130b-3p的表达水平显著高于隐性白羽鸡（Plt;0.05）；与其他周龄相比，0 W时腹部脂肪组织中gga-miR-130b-3p的表达量较高（Plt;0.01）；在腿肌组织中，2个品种间8 W与14W时gga-miR-130b-3p的表达有显著性差异（Plt;0.05），隐性白羽鸡8 W的表达显著高于S3系鸡，14 W时S3系鸡的表达显著高于隐性白羽鸡（Plt;0.05）；在腹脂细胞和肌内脂肪细胞中，gga-miR-130b-3p分化4 d后的表达均显著高于增殖期（Plt;0.01）。靶基因预测分析表明，gga-miR-130b-3p共预测到70个交集靶基因。GO和KEGG分析结果表明，ULK2和GRB10是gga-miR-130b-3p的预测靶基因。综合所述，gga-miR-130b-3p在鸡不同发育时期的表达存在显著的品种和组织差异性，gga-miR-130b-3p很可能是通过ULK2和GRB10调控脂肪沉积。

关键词：鸡；gga-miR-130b-3p；组织；细胞；表达分析；脂肪沉积

中图分类号：S831.2" 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）23-0181-06

李瑞瑞，宗" 毅，赵振华，等. gga-miR-130b-3p在鸡脂肪相关组织中的表达规律及其靶基因的生物信息学分析［J］. 江苏农业科学，2024，52（23）：181-186.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.025

收稿日期：2023-11-09

基金项目：现代农业产业技术体系建设专项（编号：CARS-41-Z05）；江苏省种业振兴揭榜挂帅项目［编号：JBGS（2021）109、JBGS（2021）029］；国家家养动物种质库建设项目（2023）；国家自然科学基金（编号：32102538）；广东省自然科学基金（编号：2022A1515012014）。

作者简介：李瑞瑞（1998—），女，山东泰安人，硕士，主要从事家禽遗传育种研究。E-mail：liruirui117@163.com。

通信作者：向" 海，博士，副教授，主要从事动物遗传育种与繁殖研究。E-mail：xh@fosu.edu.cn。

鸡肉是一种高蛋白、低脂、低胆固醇的食品，在人们的日常餐桌上占有重要地位。近年来，优质肉鸡生长性能不断改良，但同时也伴随着腹部脂肪的过度沉积。腹部脂肪的过度沉积会降低饲料转化效率，而脂肪沉积在肌肉中则会提高嫩度和风味［1］。因此，有效控制家禽脂肪沉积，对于优质肉鸡培育和肉质改善是非常有意义的。

microRNAs（miRNAs）长度为21～30个碱基，它是一种小的、非编码的RNA分子，附着在mRNA的3′-非翻译区域（3′-UTR）上，作用主要是负向调节靶基因［2］。gga-miR-130b-3p是属于miR-130/301家族的一种多功能因子，在不同疾病与生物学过程中均发挥了作用。miR-130b-3p在不同的癌症类型中具有组织特异性，如gga-miR-130b-3p过表达，可以在甲状腺腺瘤［3］和上皮性卵巢癌［4］中作为癌基因，也可以在乳腺癌［5-6］和卵巢癌［7］中发挥抑癌作用。miR-130b通过靶向Sp1转录因子抑制肌母细胞增殖并促进肌源分化［8］，miR-130b-3p通过靶向CHD9在结直肠癌肿瘤发生中起致癌作用［9］，miR-130b通过靶向PTEN可显著促进膀胱癌细胞的迁移、侵袭和增殖［10］。

近年来，有文献报道miR-130b-3p不但参与了疾病调控，同时也参与了哺乳动物脂肪代谢的调控过程。miR-130b可降低人类肌肉细胞的靶基因PPARGC1A的表达，在人类肥胖相关代谢疾病发病机制中起关键作用［11］；miR-130b可以调控参与胆固醇脂蛋白运输的关键蛋白质的表达［12］；gga-miR-130b-3p在鸡上研究还有很大的空间可以完善。有研究报道gga-miR-130b-3p通过靶向IBDV基因组和抑制SOCS5来抑制传染性法氏囊病病毒的复制［13］。目前，对于gga-miR-130b-3p与优质肉鸡脂肪沉积（腹脂和肌内脂肪沉积）的直接关系尚未见详细报道。矮小型S3系鸡是通过导入矮小基因（dw）并经多个世代的选育所形成的遗传性能稳定的品系种，体质量低于正常鸡40%左右，但脂肪沉积也更严重［14-15］，是研究脂肪沉积的理想模型。研究表明，性连锁矮小鸡的GHR基因突变能引起胫骨变短、肌肉量变少、基础代谢率降低、血液胰岛素样生长因子1（IGF-1）含量降低、血液生长激素含量升高、耐热性升高、饲料利用率升高［16］等一系列生理和表型性状的改变。本研究以江苏省家禽科学研究所自主选育的矮小品系S3和隐性白羽鸡（RR）为试验材料，分析gga-miR-130b-3p在肝脏、腹脂、腿肌组织、腹脂和肌内脂肪细胞增殖期和分化期的表达差异，将为明确miR-130b-3p对脂肪沉积的作用提供重要的前期研究基础。

1" 材料与方法

1.1" 试验材料

试验动物：0日龄（0 W）、2周龄（2 W）、8周龄（8 W）、14周龄（14 W）、16周龄（16 W）江苏省家禽科学研究所矮小品系S3系鸡（DW）和隐性白羽肉鸡（RR）各6羽。S3系鸡是利用矮小基因DW培育而成的优质肉鸡，体型较小，生长速度较慢；隐性白羽肉鸡属于快大型肉鸡，体型较大、生长周期短、肉质好。试验鸡由江苏省家禽科学研究所邵伯试验基地提供，鸡饲养期为2022年5—10月；试验在江苏农业科学院家禽研究所完成。

主要仪器：高压灭菌锅（TOMY/SX-500，日本TOMY公司），分光光度计（NanoDrop 2 000）、CO2细胞培养箱（3111），均购自美国Thermo公司；PCR扩增仪（CFX96）、荧光定量PCR扩增仪（9902），均购自美国applied biosystems公司。

主要试剂和耗材：胎牛血清（FBS，以色列BI公司），青链霉素混合液（美国Gibco公司），DME/F12培养基（SH30023.01，美国HyClone公司），D-HANKS（北京Solarbio公司），Ⅰ型胶原酶（北京英坊科技有限公司），油酸（美国Sigma公司），总RNA提取试剂盒（DP419）、miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒（KR211-02）、miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒（FP411-02）均购自天根生化科技（北京）有限公司，75%乙醇（德州名德消毒科技有限公司），15 mL离心管、10 cm培养皿、12孔板，均购自美国Corning公司。

1.2" 样品采集

对不同周龄试验鸡的肝脏、腹脂和腿肌进行取样，将收集到的样品快速的放到液氮中进行冷冻，在-80 ℃的环境下进行保存待用。

1.3" 细胞培养

将S3系7日龄母鸡置于盛有75%乙醇的烧杯中直至死亡，取腹部脂肪和腿部肌肉，放入装有 D-HANKS 的6 cm进口培养皿内，清洗2～3次。

将腹脂组织剪成小碎块，然后转移至15 mL的进口离心管中，再加入1.0～1.5倍的0.1% Ⅰ型胶原酶，在37 ℃培养箱中进行1 h消化，直至变成肉糜，再加入等体积的全培养基，使其停止消化，使用尼龙膜过滤后收集滤液并离心，去除上清液后使用10%的全培养基悬浮细胞沉淀，将培养皿放入 37 ℃ 细胞培养箱中培养。细胞融合至70%时进行传代铺板。

将腿部肌肉组织剪碎后，转移至15 mL的进口离心管中，再加入1.0～1.5倍的0.1% Ⅰ型胶原酶，置于37 ℃培养箱中进行1.5 h消化，直至变成肉糜，再加入等体积的全培养基，使其停止消化，然后进行离心。吸取上清液至T25瓶中，添加完全培养基装满T25，放入37 °C细胞培养箱中倒置培养。细胞融合至70%时进行传代铺板。

细胞传代后继续培养融合至70%，未添加油酸组的为增殖期细胞，另一组用0.1%油酸诱导分化并将此时定义为分化0 h，收集增殖期分化后1、4、6 d 的细胞。

1.4" 引物设计与合成

本项目拟在前期工作的基础上，以miRbase中的鸡gga-miR-130b-3p序列（登录号：MIMAT0026503）为切入点，采用 miRNAs Design v1.01软件，以U6为内参，设计1条引物并由生工生物工程有限责任公司进行合成。引物信息见表1。

1.5" 反转录合成与QPCR试验

利用miRNA提取分离试剂盒对不同组织和细胞样本中的总RNA进行提取，RNA浓度和纯度采用紫外分光光度计检测（1.8≤D260 nm/D280 nm≤2.0）。使用加A法，每个样本取3 μL总RNA进行反转录，然后放置于-20 ℃冰箱保存。

miRNA的荧光定量检测使用SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法，以U6为内参考基因在Aplied Biosystems 7500荧光定量PCR系统进行PCR反应。每个样本重复2次，参照日龄为矮小品系S3鸡0 W的表达量，内参基因为U6。miRNA相对表达采用2-ΔΔCT方法进行计算。

1.6" 靶基因预测及功能分析

本研究采用3种在线软件TargetScan、miRDB、miRmap等，筛选出gga-miR-130b-3p调控的下游靶基因。为了避免单一软件预测到的靶基因过少，并降低预测结果的假阳性，所以对3个软件预测中至少出现2次的基因进行选取。采用DAVID、KOBAS 3.0等在线工具，对得到的目标基因进行了GO功能分析和KEGG pathway富集分析。

1.7" 数据处理

利用2-ΔΔCT方法，对gga-miR-130b-3p在鸡各组织中的表达水平进行比较研究。结果以“平均值±标准偏差”为标准。使用SPSS 26.0软件对其进行了单因素方差分析，Plt;0.05表示差异显著，Plt;0.01表示差异极显著。

2" 结果与分析

2.1" gga-miR-130b-3p在肝脏组织中的表达

由图1可知，gga-miR-130b-3p在0 W和 16 W 肝脏组织中的表达存在明显的品种特异性（Plt;0.05）。DW的表达量在5个时间点的表达均高于RR。RR在0 W的表达显著高于其他周龄（Plt;0.05）。RR在8 W时，gga-miR-130b-3p的表达量较0、14周龄显著降低（Plt;0.05）。

2.2" gga-miR-130b-3p在腹脂组织中的表达

由图2可知，gga-miR-130b-3p在2个品种腹脂组织中的表达模式有一定的差异。gga-miR-130b-3p在RR与DW中0 W时表达量最高且极显著高于其他周龄（Plt;0.01），而在2 W后gga-miR-130b-3p的表达相对稳定，至16 W仍保持在这种低表达水平。

2.3" gga-miR-130b-3p在腿肌中的表达

由图3可知，在8 W与14 W的腿肌肉组织中，gga-miR-130b-3p的表达有明显的品种差异（Plt;

0.05），在8 W时，在DW中，gga-miR-130b-3p的表达明显高于RR，但在14 W时，gga-miR-130b-3p的表达明显低于RR（Plt;0.05）。DW各周龄间gga-miR-130b-3p的表达量无显著差异（Pgt;0.05）；在RR，gga-miR-130b-3p的表达在8 W时最低，至14 W时则显著升高。

2.4" gga-miR-130b-3p在脂肪细胞中的表达

在鸡腹脂脂肪细胞中，由图4-A可知，分化 4 d 和6 d，gga-miR-130b-3p的表达显著高于增殖期（Plt;0.05）；在肌内脂肪细胞中，图4-B可知，gga-miR-130b-3p在分化期的表达极显著高于增殖期（Plt;0.01），在分化4 d达到高峰，且至6 d时维持高表达量。

2.5" gga-miR-130b-3p靶基因预测及功能分析

由图5可知，通过不同在线软件预测到的gga-miR-130b-3p靶基因个数，TargetScan为557个，miRDB为994个，miRmap为1 625个，3个软件预测结果的交集靶基因为70个。

由70个靶基因的GO功能富集分析结果（图6）可知，靶基因主要富集于生物学过程分类中的细胞内信号转导、河马信号的负调控、信号转导、早期内体等过程；细胞组分分类中的早期内吞体膜、粘连结点、溶质：质子逆向转运蛋白活性、电压门控氯通道活动；分子功能分类中的Tau蛋白激酶活性、肝

素结合、胰岛素受体结合、无序的结构域特异性结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、金属氨基肽酶活性等。KEGG pathway富集分析结果（图7）表明，靶基因主要富集到代谢途径（HPRT1、UXS1、MAT2B）、mTOR信号通路（ULK2、RRAGD、GRB10）、自噬-动物（ULK2、RRAGD、ATG16L1、PRKACB）、内吞作用（SNX2、STAM、CLTC）等途径中。

3" 讨论

本研究结果表明，在肝脏组织中，gga-miR-130b-3p在S3系鸡和隐性白羽鸡中表达规律有所差异，S3系鸡gga-miR-130b-3p在肝脏中的表达量始终高于隐性白羽鸡，在腹脂组织中，0～2 W隐性白羽鸡gga-miR-130b-3p的表达量高于S3系鸡。在腿肌组织中gga-miR-130b-3p的表达量8 W以前S3系鸡高于隐性白羽鸡，这可能是早期发育中隐性白羽鸡腿肌的脂肪沉积早于S3鸡。综上所述，gga-miR-130b-3p参与了脂肪沉积的过程，且在不同品种中参与脂肪调控的时间及充当的角色均是不同的。gga-miR-130b-3p在体外腹脂和肌内脂肪细胞增殖期均显著低于分化后期，推测gga-miR-130b-3p主要在脂肪细胞分化期起调控作用。有文献研究报道，miR-130b通过靶向PPAR-γ抑制人原代前脂肪细胞和3T3-L1小鼠脂肪细胞中脂肪生成［17］，miR-130b-3p能够以胞外囊泡的形式进入到脂肪细胞中，并且能够抑制猪前体脂细胞的脂肪分化［18］；miR-130b-3p通过靶向KLF3抑制山羊肌内脂肪细胞分化［19］；miR-130b 通过靶向肉牛PPARG和CYP3U2的 1′UTR 直接影响脂肪细胞分化［20］；在家兔中miR-130b抑制前体脂肪细胞分化；在鸡肝癌细胞中，INSIG1基因下调导致ACSL1、MTTP-L、ApoB、ApoVLDLII基因表达及甘油三酯及甘油含量显著降低，miR-130b-3p直接靶向INSIG1基因［21］。因此推测，miR-130b-3p可能参与了家禽和哺乳动物的脂肪代谢过程，此外，miR-130b-3p对脂肪细胞分化和脂肪细胞增殖也具有重要作用。

gga-miR-130b-3p通过不同的靶基因在不同物种的相关性状中发挥作用，如何准确预测靶基因是研究miRNA功能的难点和重点问题。本研究采用3种预测软件共筛选到70个预测靶基因，显著富集在代谢途径、mTOR等信号通路，其中富集在mTOR信号通路里的ULK2和Grb10与脂肪代谢密切相关。ULK2调节脂肪细胞的脂质代谢和葡萄糖摄取［22］；Grb10通过抑制mTORC1磷酸化依赖反馈促进脂肪分解和产热［23］，通过对小鼠模型的研究发现Grb10蛋白可以促进大脑中瘦素（Leptin）的活性，Grb10直接与神经元上的瘦素受体结合，形成复合物，增强瘦素信号，有助于减少食物摄入，增加能量消耗［24］。gga-miR-130b-3p对优质肉鸡腹脂和肌内脂肪沉积的具体作用及其靶向基因的鉴定，在后期的研究中将会进一步通过体外功能试验来证实。

4" 结论

gga-miR-130b-3p在不同发育阶段的肝脏、腹脂和腿肌组织中存在差异表达模式。推测gga-miR-130b-3p对鸡脂肪代谢的调控主要是通过mTOR通路来实现，ULK2和Grb10将是重点关注的靶基因。

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