梨星毛虫USP基因的鉴定与时空表达特征分析

摘要：本文筛选鉴定了梨星毛虫蜕皮激素相关基因USP，分析了其在不同组织和不同发育阶段的表达模式。结果表明，USP基因核苷酸长609 bp，氨基酸长度为203 aa，蛋白质相对分子量23.198 kD，等电点为7.83，蛋白质二三级结构主要由α螺旋和无规则卷曲组成。USP基因的表达具有组织特异性，在消化道表达最高；USP基因在梨星毛虫各生长发育阶段中除1龄幼虫外均有不同程度的表达，USP在3龄幼虫高表达且与其他发育阶段差异显著。研究结果为进一步探究USP在参与调控梨星毛虫生长发育中的机制奠定了基础。

关键词：梨星毛虫；USP；生物信息学；表达模式

中图分类号：S433.4 文献识别码：A 文献编号：1005-6114（2024）06-012-04

昆虫生长发育调控基因参与代谢、蜕皮和生殖等过程，在细胞间信号传递和激素调控等生命活动中起重要作用［1，2］。昆虫蜕皮激素（ecdysone，20E）在昆虫生长发育中起到重要的调控作用，其相关基因是典型的调控基因［3］。USP基因编码的超气门蛋白（Ultraspiracle，USP）能与保幼激素（Juvenile Hormone，JH）和20E结合，进而调节多个下游基因表达，影响昆虫幼虫期和蛹期影响昆虫蜕皮和发育［4-6］。随转录组测序技术进步，在家蚕Bombyx mori、果蝇Drosophilid spp.等模式昆虫的基因库被完善的基础上，多种昆虫的生长发育调控基因被逐步鉴定出，进一步挖掘这些基因的结构和表达特性，有助于深入理解昆虫生长发育调控机制［7］。

梨星毛虫Illiberis pruni隶属鳞翅目斑蛾科，是我国北方常见的食叶类害虫，以幼虫阶段危害梨、海棠、苹果等蔷薇科果树［8-10］。该虫幼虫龄期划分在5～7龄间，不同地区的生活史表明该虫一年发生一代，各阶段发生整齐［11］。成虫于夏季产卵，2～4龄幼虫在10月越冬，越冬代幼虫具有食量大、体积增长快、活动能力强的特点［12］。其幼虫阶段的卷叶取食习性除直接危害寄主外，也能影响光合效率使树势衰弱，间接导致果品减产［13］。一直以来，多地都有梨星毛虫相关报导，但该虫在不同地区发生规律有较大差异，其蜕皮次数在不同地区亦有较大差别，反映出该虫对外界环境较强的适应性和生长发育机制的特殊性［14］。生长发育调控基因的鉴定和表达对于揭示昆虫生长发育过程中的分子机制具有重要的意义。为此，本研究拟对梨星毛虫超气门蛋白基因USP鉴定的基础上，分析其在幼虫不同组织（头部、体壁、消化道、脂肪体）和不同生长发育阶段（卵、1～7龄幼虫、蛹、雌雄成虫）的表达水平，以期为进一步研究梨星毛虫生长发育调控基因的功能提供基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

梨星毛虫5、6龄幼虫于2023年5-6月采集自青海省西宁市（36°65′05″ N，101°69′93″ E，海拔2 261 m），采回后将部分样品在养虫笼用水培梨树枝条饲养至化蛹，将蛹单独隔离至离心管中羽化，之后对成虫性别进行鉴定，并挑取部分雌雄成虫在养虫盒内（10×15 cm）两两配对，将新鲜梨树叶片叶背向上置于盒底部，在养虫盒内壁滴加蜂蜜水用作饲养成虫，在成虫交配后收集叶片得到卵块，将之置于培养皿中定期喷水保持湿度直至孵化，在上述步骤中收集7龄幼虫、蛹、成虫、卵和1龄幼虫样品。2、3、4龄幼虫于7-9月采自原室外发生地。观察发现梨星毛虫6龄幼虫期间食量大且体型增长明显，因此选定6龄幼虫作为组织表达对象。解剖梨星毛虫6龄幼虫将之分为头部、体壁、肠道和脂肪体4个部位的组织。同时收集梨星毛虫不同发育阶段样品（卵、1～7龄的幼虫、蛹、雌雄成虫），每种样品准备3组生物学重复，收集后用液氮速冻分装，之后立即置于-80℃冰箱中冷冻保存以保证样品质量。

1.2 总RNA提取及cDNA合成

本研究根据Solarbio法操作得到梨星毛虫卵、1～7龄幼虫、蛹、雌雄成虫和6龄幼虫头部、体壁、脂肪体、消化道的总RNA。使用超微量分光光度计检测RNA纯度，OD260/OD280值在1.8～2.2之间（OD260/OD280值的范围在1.8～2.2之间时，表示提取的RNA纯度良好）。为评估RNA的完整性和是否存在DNA污染，用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。使用反转录试剂盒（艾德莱，北京）进行cDNA的第一链合成。将处理好的RNA样品置于-80℃冰箱中保存，将cDNA样品封装后保存在-20℃的冰箱中。

1.3 引物设计与合成

从梨星毛虫转录组基因序列库中筛选获得USP序列，内参基因（RPS11）由青海大学昆虫实验室筛选获取，引物序列通过Oligo7软件设计并委托北京睿博兴科生物技术有限公司合成（表1）。

1.4 梨星毛虫生长发育调控基因的基因序列获取

基于幼虫、蛹和成虫转录组数据库，以基因缩写USP，ecdysone，ultraspiracle，20E，ECR，为关键词在Unigenes数据库中筛选出调控生长发育相关注释的基因序列号。通过序列号在总库获取其核苷酸序列，将所有筛选出的核苷酸序列通过BLASTn比对在NCBI数据库中确定候选序列。使用在线平台ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测出USP的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），将USP的完整核苷酸和氨基酸序列，通过BLASTp进一步验证预测ORF氨基酸序列的准确性，设定相似性大于70%的阈值，最终确定生长发育调控基因的氨基酸序列。

1.5 梨星毛虫生长发育调控基因的生物信息学分析

利用ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）软件对USP基因的氨基酸序列组成进行预测、同时对其理性化性质进行分析。通过Signalp5.0（http：//cbs.dtu.dk/services/Signalp/）预测其信号肽。采用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa%20_sopma.html）进行蛋白质二级预测；利用SWISS MODEL（https：//www.Swiss model.expasy.org/）对蛋白质的三级结构预测。

1.6 梨星毛虫生长发育调控基因的RT-qPCR检测

用梨星毛虫不同组织和不同发育阶段虫体获得的cDNA样品作为模板进行实验。每组生物学重复进行3次技术重复。本实验使用ABI 7500型实时荧光定量PCR仪进行RT-qPCR反应。实验扩增体系与反应条件参照南彦斌等人研究［15］。

1.7 统计分析

用2-ΔΔCt值法计算梨星毛虫生长发育调控基因在不同组织和不同发育阶段中的相对表达量。使用SPSS 26.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析（ANOVA）来比较生长发育调控基因在不同组织和不同发育阶段的表达量差异。用Graphpad prism10.0软件绘制基因的组织表达谱和龄期表达谱，同时利用Duncans新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 生物信息学分析

在梨星毛虫的转录组数据库（幼虫、蛹、成虫）中筛选出5个生长发育调控基因，通过ORF finder获取氨基酸序列并通过NCBI BLASTp验证，核苷酸长度为609 bp，氨基酸长203 aa。利用TransDecoder软件预测出USP的编码区序列具有完整性。利用在线网站SignaIP5.0预测确定USP无信号肽。通过BLASTn验证发现，USP基因与草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda USP序列相似度为91.74%。

2.2 蛋白质理化性质分析

通过ExPASy-ProtParam tool对USP基因的蛋白质的理化性质预测。结果表明，USP基因氨基酸长度为203 aa，相对分子量23.198 kD，理论等电点是7.83，属于弱碱性蛋白；蛋白质带正电荷和负电荷残基数目基本相同，氨基酸不稳定系数高于40，表明其性质不稳定。从脂肪系数可以看出USP基因的蛋白具有热稳定性。总平均疏水性都介于-0.5～0.5之间。因此，判定为两性蛋白质。

2.3 蛋白质结构预测分析

利用SOPMA在线网站和SWISS MODEL网站同源建模预测USP基因的蛋白质二级结构。结果发现，无规则卷曲是二级结构主要构成部分，比例为42.86%，其次是α螺旋，占比38.74%，延伸链则为14.72%，β折叠含量较低为3.68%。USP基因的蛋白质三级结构显示α螺旋均匀分布在蛋白质各个位置，无规则卷曲环绕在蛋白周围（图1）。

2.4 组织表达与龄期表达分析

以6龄幼虫头部作为阳性对照，测定发现USP基因在梨星毛虫6龄幼虫不同组织（头部、脂肪体、体壁和消化道）的相对表达水平不同（图2，A）。USP在头部、脂肪体、体壁和消化道上均有表达，且体现不同的表达水平。USP在消化道的相对表达量最高，表达水平与头部、体壁差异显著（P＜0.05）。

通过RT-qPCR测定USP在梨星毛虫卵、1～7龄幼虫、蛹、雌雄成虫的相对表达水平，以雌成虫作为阳性对照（图2，B）。结果表明，USP表达水平在整个发育阶段中差异明显。USP在3龄幼虫阶段相对表达量最高与其他发育阶段表达水平差异显著（P＜0.05），其他阶段相对表达量均低，在1、2龄幼虫和蛹期几乎不表达。

3 结论与讨论

本研究通过生物信息学方法对梨星毛虫生长发育调控基因USP进行分析，发现USP基因的蛋白无信号肽，与白背飞虱Sogatella furcifera的USP预测结果一致［16］。结合蛋白质二级结构和三级结构发现USP基因的蛋白含有大量无规则卷曲，表明其部分结构容易改变，不稳定的空间结构利于识别反应底物，推测该蛋白可能有适应结合配体和参与信号转导功能，具体机制有待于进一步探究［17］。

时空表达谱分析结果表明，USP在梨星毛虫幼虫不同组织上均有表达且呈现不同表达水平。USP在消化道中相对表达量与其他组织呈显著差异，这一结果与云杉芽卷蛾Choristoneura fumiferana USP基因组织表达结果相同；在消化道高表达说明USP基因可能参与到消化器官和分泌器官中多种生理过程，推测USP基因在能量代谢过程中具有重要作用［18］。USP在梨星毛虫不同发育阶段（卵、1-7龄幼虫、蛹、雌雄成虫）呈现不同表达水平，USP在3龄阶段幼虫中的表达水平均表现出上调趋势，结合前人研究发现此阶段为越冬前期，推测该基因参与了幼虫越冬前能量代谢［19］。梨星毛虫在6龄幼虫阶段大量取食叶片能为化蛹提供营养物质积累，USP在这一阶段显著表达可能与化蛹前代谢活动有关［19］。此外，USP在梨星毛虫雌雄成虫中相对表达量有差异，推测USP基因对雌雄性别的发育起不同作用［20］。

本研究从梨星毛虫转录组数据库中鉴定出蜕皮激素受体蛋白USP基因，通过一系列生物信息学分析发现USP基因的基本特性与同族基因相似，表达谱分析显示USP基因的时空表达模式具有特异性。以上结果为进一步揭示梨星毛虫生长发育分子调控机制奠定基础。

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