杉木育种群体遗传多样性评价及核心种质构建

摘 要：【目的】评价湖南省杉木不同世代育种群体遗传多样性及其变化动态，构建核心种质，旨在为湖南省杉木下一轮遗传改良及种质利用提供理论依据和材料支撑。【方法】利用21对能获得多态性SSR引物对3个不同世代杉木育种群体中的137份样本进行PCR扩增，采用Gene Marker软件进行基因分型，利用GenAlex软件估算群体遗传参数、检测Hardy-Weinberg平衡并进行分子方差分析，利用GENEPOP软件估算无效等位基因频率，利用FSTAT软件评估成对育种群体间的遗传距离，利用STRUCTURE软件分析群体遗传结构，利用Darwin软件构建邻接系统发育树，利用Core-hunter软件构建核心种质，采用t检验和主坐标分析法验证核心种质的有效性和代表性。【结果】湖南省杉木整个育种群体（HO=0.541，HE=0.630）遗传多样性丰富，3个不同世代的育种群体均表现为杂合体缺失，显著或极显著偏离Hardy-Weinberg平衡；整个育种群体中的种质可聚为2大类群，种质间普遍存在亲缘关系；不同世代育种群体间遗传分化较小（FST为0.010～0.014）；以40%的抽样比例构建核心种质，同源性为14.55%，等位基因覆盖度为100%，群体遗传参数与整个育种群体差异不显著，核心种质在所有种质的主坐标中均匀分布。【结论】湖南省杉木多世代遗传改良策略科学合理，各世代育种群体遗传多样性较高，育种群体遗传多样性并没有因遗传改良进程而下降。构建的55份核心种质保留了整个育种群体全部等位基因，有效地限制了同源性，符合生物核心种质的构建要求，可为湖南省杉木种质创新、资源高效利用及高世代种子园建设提供优异的种质材料。

关键词：杉木；育种群体；SSR标记；遗传多样性；核心种质

中图分类号：S718.43 文献标志码：A 文章编号：1673-923X（2024）09-0118-09

基金项目：国家重点研发计划项目（2022YFD2200201）；湖南省林业科技攻关与创新项目（XLKJ202301）。

The evaluation of the genetic diversity of breeding populations and construction of a core collection of Cunninghamia lanceolata

ZHANG Xie1，2， WU Hanbin3， CHENG Yong1， ZHANG Chunyan4， WANG Xin2， JIANG Hongchun4， ZHANG Senqiang4， DUAN Aiguo5

（1. Hunan Academy of Forestry， Changsha 410004， Hunan， China； 2. School of Forestry， Central South University of Forestry & Technology， Changsha 410004， Hunan， China； 3. Central South Survey， Planning and Design Institute， Changsha 410007， Hunan， China； 4. Guangping State owned Forest Farm in Huitong County， Huitong 418307， Hunan， China； 5. Institute of Forestry， Chinese Academy of Forestry， Beijing 100091， China）

Abstract：【Objective】A core collection of germplasm construction and assessing on the dynamic evolution of genetic diversity over generations of Chinese fir was studied in Hunan province in order to provide theoretical basis and material support for the next generation genetic improvement and germplasm utilization.【Method】A total of 137 samples from 3 different generations of Chinese fir breeding population were displayed substantial genetic diversity analyzed by PCR with 21 polymorphic SSR primers. The Gene Marker software was used for genotyping， and GenAlex software was employed to estimate population genetic parameters， assess Hardy-Weinberg balance， and execute molecular variance analysis， GENEPOP software for frequency of invalid alleles estimation； FSTAT software for genetic distance evaluation between pairs of breeding populations； STRUCTURE software for genetic structure of populations analysis； Darwin software for Neighbor-Joining（NJ） phylogeny construction； and Core-hunter software for construction of core collection； and t-test and principal coordinates analysis （PCoA） were used to verify the validity and representativeness of the core collection.【Result】The whole breeding populations of Hunan province Chinese fir displayed substantial genetic diversity （HO=0.541， HE=0.630）， and three breeding populations of different generations showed heterozygotes loss， which highly significant difference or significantly difference deviated from Hardy-Weinberg equilibrium； the germplasm in the whole breeding population was clustered into two groups， genetic relationships exist among the collection； genetic differentiation among different breeding populations was minimal （FST between 0.01 and 0.014）， the core collection constructed with 40% sampling ratio had 14.55% homology and 100% allelic coverage， the genetic parameters of the population were not significantly different from that of the whole breeding population， and the core collection are evenly distributed in the principal coordinates of reserved collection.【Conclusion】The multi-generation genetic improvement strategy of Chinese fir in Hunan province is scientific and rational. High genetic diversity has been maintained across all breeding populations generations without decline through the genetic improvement process. The constructed 55 core collection retain all alleles of the whole breeding population， effectively limit the homology and meet the requirements of the construction of biological core collection， which can supply superior germplasm materials for germplasm innovation， efficient resource utilization and high-generation seed orchard construction of Chinese fir in Hunan province.

Keywords： Cunninghamia lanceolata； breeding population； SSR marking； genetic diversity； core collection

林木育种群体遗传多样性是林木遗传改良的物质基础，决定着苗木的遗传品质，影响人工林的产量和质量及其生态系统的长期稳定，在林业产业发展中具有重要的地位[1]。林木遗传改良主要借鉴作物和动物育种中成效显著的轮回选择策略，构建遗传品质不断提高且遗传基础不断拓展的育种群体，是高世代林木遗传改良是否成功的根本，备受关注[2-3]。随着林木遗传改良进程的推进，种质材料不断积累，种质资源保存与管理等问题日益凸显[4]。为了提高种质利用率，核心种质的概念及其构建方法得以提出和发展[3-4]，并逐步成为植物种质资源与遗传改良的主要研究内容[5]。近四十年来，已构建了100多种作物核心种质，为作物种质创新与遗传改良奠定了坚实的基础[6]，但是，林木核心种质构建工作相对滞后[7-8]。

杉木Cunninghamia lanceolata具有生长快、产量高、材质优、用途广等优点，是南方各省主要造林树种之一，在我国储备林建设的战略中具有重要地位[9]。目前，大部分杉木分布的省（区）已开展了种源试验、优树选择与收集、生产（育种）群体与子代测定林（群体）建设等遗传改良工作[10]，但是，杉木育种群体遗传多样性及核心种质构建的系统研究不多[11-15]，已有的核心种质构建报道主要是从地理起源的角度来考虑的。随着杉木遗传改良进程的推进，我国南方各省（区）之间的杉木种质材料交流频繁，育种群体中的种质可能存在着较为复杂的亲缘关系[13]，因此，明晰杉木育种群体中种质间的亲缘关系，构建核心种质的工作已刻不容缓。有研究[16]表明，与其他核心种质构建方法相比，基于A-NE（average distance between each accession and the nearest entry）标准和E-NE（average distance between each entry and the nearest neigh -boring entry）标准构建的核心种质更具有代表性。Wu等[15]利用A-NE和CV（allele coverage）方法构建杉木核心种质，已取得了良好的效果。

本项目组是开展杉木遗传改良工作较早的单位之一，自20世纪70年代以来，较为系统地开展了杉木遗传改良工作，已于2012年进入了第3代杉木遗传改良[17-19]。随着杉木种质数量的增多，增加了种质管理成本及种质筛选的难度。本研究以杉木3个不同世代育种群体为研究对象，分析杉木不同世代育种群体遗传多样性及其变化动态，并构建核心种质，旨在提高杉木种质资源利用效率，为杉木可持续遗传改良提供理论依据和材料支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

杉木第1代、第2代和第3代育种群体均建立在湖南省会同县广坪国有林场。其中，第1代育种群体（HN1）收集、保存的无性系种质68份分别来自于湖南省会同、靖州、攸县、江华、桃源等县（市）；第2代育种群体（HN2）的39份无性系种质来源于第1代育种群体全同胞及半同胞子代测定林（配合选择，优良家系中选择1株优良单株）以及湖南省资兴市杉木人工林中的优树；第3代育种群体（HN3）的30份无性系种质来源于第2代育种群体全同胞子代及部分半同胞子代。

1.2 方 法

1.2.1 样品采集与DNA提取

采集杉木种质当年生嫩芽，硅胶干燥保存。基因组DNA提取采用改良CTAB法[20]。

1.2.2 SSR引物PCR扩增与基因分型

SSR引物标记信息见表1。

PCR扩增体系为：50 ng基因组DNA模板，0.6 μL 10 μm F引物（包括荧光引物），0.6 μL 10 μm R引物，12.8 μL 1.1×Golden Star T6 Super PCR Mix。

PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s；56～66 ℃退火45 s（退火温度因引物而异，表1），72 ℃延伸30 s，40个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。

采用Gene Marker V 4.0软件（http：//www. lifetechnologies.com/cn/zh/home/technical-resources/ software-downloads. html），判读PCR扩增结果，统计电泳片段大小。1条带，视为纯合子；2条带，视为杂合子。

1.2.3 群体遗传参数估算

采用GenAlex V6.5.1 （http：//biology-assets.anu. edu.au/GenAlEx /Download.html）估算单位点上观测等位基因数（NA）、有效等位基因数（NE）、观测杂合度（HO）、期望杂合度（HE）、近交系数（FIS）和香农多样性指数（I），并检测HardyWeinberg平衡。采用GENEPOP4.7（https：//genepop. curtin.edu.au/）估算无效等位基因频率（PN）。

采用FSTAT 2.9.3（http：//www. bio-soft.net/tree/ FSTAT.htm）估计稀疏指数校订后的等位基因丰富度（AR）和成对群体间遗传分化系数（FST）。

采用PowerMarker V3.25（http：//statgen.ncsu.edu/ powermarker/index.html）估算多态性信息含量（PIC）。

1.2.4 遗传距离分析

采用Structure 2.3（http：//pritch.bsd. ushicago. edu/structure.html）设定混合模型，类群数（K）为1～5，重复10次；迭代次数（burn-in lengths）和马尔可夫链（MCMC）分别设置为100 000和1 000 000。运行结果上传至Structure HARVESTER（http：//taylor0. biology.ucla.edu/structure Harvester/），获得独立运行单个K值的后验概率lnP（D）散点图及ΔK与K值关系折线图，折线图中的ΔK最大值对应的K值为最佳类群数。确定K值之后，基于Structure分析的个体归属各类群的比率（Q），绘制可视化群体遗传结构图。

采用GenAlEx 6.5.1软件进行分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）。

采用Darwin6.0软件[21]计算基于种质间成对遗传距离，使用NJ（Neighbor-Joining）算法（Kimura 2-parameter 模型，bootstrap值设置1 000次）构建系统发育树，并使用MEGAV7.04[22]软件进行查看。

1.2.5 核心种质构建与评价

采用Core-hunter 3软件[23]，设置MR（Modified Rogers distance）和SH（Shannon，s diversity index）的权重分别为50%，分别在10%、20%、30%、40%和50%的取样比例条件下构建核心种质。

使用COANCESTRY软件[24]中的TrioML（triadic maximum likelihood）选项[25]，估算种质间亲缘系数（r）。理论上，无亲缘关系，r=0；半同胞子代，r=0.25；全同胞子代或亲本-子代，r=0.50；无性系分株，r=1.00 [26]。

一级亲缘关系的标准为r≥0.451 1[27]，包括无性系分株、亲本-子代、全同胞子代。

采用R软件，基于Dunnett法，对构建的核心种质和整个育种群体遗传多样性参数NE、HE、Ho和I值进行t检验，评价核心种质的代表性。采用主坐标分析法（Principal coordinate analysis，PCoA）对构建的核心种质和整个育种群体中的种质进行比较分析，以确定构建核心种质的代表性。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性

利用21对SSR引物对3个杉木不同世代育种群体中的137份无性系种质进行PCR扩增，共检测到191个等位基因。每条SSR引物位点上的等位基因数目（NA）为5（wx3）～23（SM37），差异较大，平均值为9.095；单个引物位点的有效等位基因数目（NE）和等位基因丰富度（AR）的变动幅度分别为1.378～11.993和4.905～22.706，平均值分别为3.773和8.998；观察杂合度（HO）和期望杂合度（HE）分别为0.263～0.897和0.274～0.917，平均值分别为0.557和0.638（表1）。这表明，杉木各世代育种群体遗传多样性丰富。引物位点多态信息含量（PIC）为0.260至0.911，平均值为0.593。其中，0.250.50的引物位点14个，为高度多态位点。这表明，各条SSR引物位点多态性较高，能较好地检测群体遗传多样性水平。引物位点的近交系数（FIS）为-0.132～0.609，除了引物位点SM51、wx2、wx2-2、wx2-11外，大多数位点呈现显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）偏离Hardy Weinberg平衡。无效等位基因频率（PN）为0.000～0.153，表明各引物位点不存在无效等位基因。

杉木3个不同世代的育种群体遗传多样性比较分析的结果（表2）表明，杉木第1代（HN1）、第2代（HN2）和第3代（HN3）育种群体中，21对SSR引物检测到等位基因数目分别为154、156和142。单个引物位点上的等位基因数目分别为7.333、7.429和6.762；有效等位基因数目分别为3.452、3.834和3.545；观察杂合度分别为0.528、0.575和0.525；期望杂合度分别为0.601、0.639和0.634；香农多样性指数分别为1.284、1.334和1.382。这表明，湖南杉木3个不同世代育种群体遗传多样性较为丰富。不同世代杉木育种群体的近交系数（FIS）均大于0，都表现为杂合体缺失。第2代育种群体显著（P<0.01）偏离Hardy Weinberg平衡，第1代和第3代育种群体极显著（P<0.01）偏离Hardy Weinberg平衡。

2.2 群体遗传分化

采用FSTAT软件估算的不同世代育种群体间成对遗传分化系数（FST）为0.01～0.014，表明不同世代杉木育种群体间遗传分化较小，存在较强的基因流。分子方差分析（AMOVA）的结果表明，群体内的遗传变异大于不同世代群体间的遗传变异，其中，98%的变异来源于群体内部，仅有2%的变异来源于群体间（表3），不同世代群体间遗传差异不显著（P>0.05）。

基于Bayesian聚类原理的Structure软件分析结果表明，K=2时，对应的ΔK值最大，表明整个杉木育种群体中的137份种质最合理的聚类组数为2。在K=2情况下，基于每份种质归属于各类群的比值（Q），绘制Structure分析结果的直方图（图1）。由图1可知，大多数杉木种质的Q值为0.4～0.6，这暗示着湖南省不同世代杉木育种群体中的种质谱系不清晰，普遍存在亲缘关系。

基于杉木所有世代育种群体中的种质间成对的遗传距离，按照系统发育树总距离最短的原则，构建NJ系统发育树（图2）。由图2可知，与 Structure聚类的结果基本一致，湖南省整个杉木育种群体中的种质在NJ系统发育树中交错分布。

2.3 核心种质构建

运行Core-hunter 3软件，设置不同抽样强度，生成的入选种质数量与等位基因保留百分比之间的关系见表4。由表4可知，入选种质数量为55份时，等位基因保留比例达到100%。这表明，构建的55份杉木核心种质，在遗传多样性方面可以代替杉木所有世代育种群体中的137份种质，遗传冗余明显降低。55份核心种质中，来自第1代育种群体25份种质（图2）贡献率为45.45%，高于第2代育种群体（贡献率为32.73%）和第3代育种群体（22.12%），不同世代育种群体对核心种质的比例随着世代的增加而增加。

2.4 核心种质评价

基于COANCESTRY软件中TrioML估计亲缘系数（r）值的结果（表5）表明，3个不同世代的杉木育种群体中的137份无性系种质中，63份种质为全同胞或亲本-子代关系（r>0.451 1），一级亲缘关系占比为45.99%。核心种质中的8份种质间存在一级亲缘关系，占整个55份核心种质的14.55%，分别来源于第1代育种群体1份、第2代育种群体5份、第3代育种群体2份。

采用主坐标分析（PCoA）比较构建的核心种质和所有世代杉木育种群体种质的遗传结构几何分布（图3），结果表明核心种质在所有世代育种群体种质的主坐标中均匀分布。这表明，核心种质能够全面代表湖南省杉木所有世代育种群体种质资源。

杉木育种群体核心种质的有效等位基因数（NE）、观测杂合度（HO）、Shannon’s信息多样性指数（I）和期望杂合度（HE）分别为3.782、1.380、0.541、0.629。Dunnett检验的结果表明，核心种质群体遗传参数与整个育种群体（保留种质）差异不显著（表5）。

3 讨论与结论

3.1 讨 论

林木育种群体遗传多样性一直是研究者关注的焦点，对林木遗传改良的理论与实践具有非常重要的意义。李霞等[11]的研究表明，随着杉木遗传改良程度的推进，育种群体遗传多样性呈现逐步降低的趋势。本研究的结果与马尾松[28]、油松[29]、华北落叶松[30]、日本落叶松[31]等树种育种群体遗传多样性研究结果相类似，湖南省杉木不同世代育种群体维持较高的遗传多样性，第2代育种群体遗传参数最高，这可能与第2代育种群体构建时补充新种质的育种策略有关[17，32]。

本研究表明，不同世代杉木育种群体间遗传分化较小，育种群体中的种质材料来源于2个祖先类群。这与杉木种子园[13]和地理种源[33]的研究结论相似。这是因为，随着杉木育种世代的增加，下个世代育种群体中的种质主要来源于当代育种群体后代，不同世代育种群体中少数种质存在亲本-子代间的一级亲缘关系。

多年生林木占地面积大，采集和保存困难，可靠的表型数据需要多年时间才能获取。分子标记技术不受外界环境和植物生长发育阶段的影响，已成为构建林木核心种质和评估遗传多样性的首选技术手段[34-35]。构建核心种质的目的是以最少种质数量代表初始种质资源遗传多样性，以减轻种质资源库管理的成本，提高种质资源的利用率，因此，核心种质构建策略极为关键。基于分子标记数据构建核心种质的策略，大体可分为M策略和遗传距离策略。M策略是基于每个位点上等位基因数目最大化，以减少种质材料的冗余。该策略能捕获大部分遗传多样性，被广泛应用于植物分类和种质保存工作中，但经常会得到代表性差的种质（异常类型）。遗传距离策略是将测试材料分层或聚类，使用不同的分组方法从不同组中筛选核心种质。同源性较低的种质是杂交制种和创造新种质的前提条件，因此遗传距离策略可以降低核心种质间的亲缘关系，筛选的种质具有很好的代表性，更适合于遗传改良工作，但该策略在等位基因保留比例方面不太理想。Core Hunter软件基于两种优化标准，同时优化遗传距离和最大化等位基因保存率。本研究采用Core Hunter软件构建的55份杉木核心种质，等位基因覆盖率为100%，同源系数为14.55%，能够满足多世代杉木可持续遗传改良和种质创新的需要。

本研究构建的杉木育种群体核心种质中有8份种质存在一级亲缘关系，这是由于杉木育种群体构建中，下代育种群体中的种质来源于上代群体的子代，存在亲本-子代关系。从植物核心种质构建的基本目的考虑，应保留55份种质，以防止稀有等位基因丢失。但从林木遗传改良策略的角度考虑，应控制共祖率，剔除存在一级亲缘关系的种质（本研究中存在8份），以避免近交的抑制作用对杉木高世代遗传改良可能产生的严重后果。

本研究构建的杉木核心种质代表了湖南省3个杉木育种群体的遗传多样性，但核心种质数量和构建方法应保持动态。因此，要定期对杉木育种群体核心种质进行修订，包括引入湖南省以外的优异种质、新的标记方法（如功能标记）等工作，以拓宽湖南省杉木育种群体的遗传基础，提高杉木核心种质的遗传代表性，最大程度提高单位时间内杉木高世代遗传改良效果。

3.2 结 论

基于SSR分子标记揭示的湖南杉木不同世代育种群体遗传多样性丰富，表明湖南省已开展的杉木多世代遗传改良策略科学合理。采用基于遗传距离策略的Core Hunter法构建的杉木核心种质，等位基因覆盖率达100%，遗传多样性参数与所有世代育种群体的差异不显著，表明本研究构建的核心种质有效。研究结果不仅有助于提高杉木种质资源的利用效率，为杉木可持续遗传改良提供理论依据和材料支撑，也为其他林木遗传改良的育种群体核心种质构建提供重要的参考。

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[本文编校：谢荣秀]