母树年龄和复幼对锥栗插穗生理及不定根发生的影响

摘 要：【目的】探讨母树年龄及基部促萌复幼对锥栗Castanea henryi半木质化嫩枝扦插生根的影响，从生理水平和解剖结构特征解析其可能原因，为锥栗扦插繁殖提供理论和实践指导依据。【方法】对2年生和8年生锥栗母树分别进行基部截干促萌复幼处理，以当年生半木质化的新枝为试材，以不截干枝条为对照，分别于扦插后0、7、14 d取插穗基部，通过制作石蜡切片对插穗生根部位进行解剖观察，测定可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、木质素含量、氧化酶活性、激素水平的动态变化，并于扦插后60 d统计各处理的扦插生根率和生根数量。【结果】1）扦插14 d后，可见2年生锥栗插穗有不定根长出，8年生锥栗插穗基部有白色突起。2）母树年龄越大，扦插生根率越低，且基部促萌复幼对锥栗插穗不定根的影响不显著（P>0.05）。2 a对照、2 a复幼的生根率（68.0%、70.0%）和每插穗不定根数量（11.3、10.6）显著高于8 a对照和8 a复幼的生根率（3.2%、4.4%）和每插穗不定根数量（3.2、2.9）（P<0.05）。3）8 a插穗木质素含量在不定根发生过程中显著高于2 a插穗（P<0.05），且复幼不能降低插穗木质素含量。扦插7 d后8 a插穗的可溶性蛋白含量在对照和复幼处理中均显著低于2 a插穗（P<0.05）。4）在不定根发生过程中，IAAO酶活性在不同年龄和复幼插穗间差异均不显著（P>0.05）；8 a插穗的IAA水平显著高于2 a插穗（P<0.05）。扦插7 d后，2 a锥栗插穗的SOD显著高于8 a锥栗插穗（P<0.05），8 a插穗的GA3含量显著高于2 a插穗（P<0.05）。【结论】母树年龄是影响锥栗插穗不定根发生的主要要素，单纯基部平茬促萌复幼措施可能不适宜被用来提高锥栗成年插穗的不定根发生率。调控木质素的合成和代谢途径可能是提高锥栗成年插穗不定根发生的关键。

关键词：母树年龄；复幼；不定根发生；锥栗

中图分类号：S723.1+32.5 文献标志码：A 文章编号：1673-923X（2024）09-0038-12

基金项目：国家自然科学基金项目（32001309）；中央财政林业科技推广项目（[2021]XT01）；湖南省教育厅优秀青年项目（21B0266）。

Influence of mother tree age and rejuvenation on the physiology and adventitious root occurrence of Castanea henryi scions

PU Yao， LI Ying， WANG Tao， YU Siyuan， ZOU Feng， YUAN Deyi， XIONG Huan

（a. College of Forestry； b. Forestry Cultivation Laboratory， Central South University of Forestry & Technology， Changsha 410004， Hunan， China）

Abstract：【Objective】This study aims to investigate the effects of mother tree age and basal rejuvenation on the semi-lignified softwood cutting rooting of Castanea henryi， and analyze the possible reasons from physiological and anatomical characteristics aspects， providing theoretical and practical guidance for C. henryi propagation by cutting.【Method】Basal rejuvenation treatments were carried out on 2-year-old and 8-year-old C. henryi mother trees， with the new semi-lignified branches as the experimental material， and branches from non-rejuvenated trees as the control. The basal portions of the cuttings were taken at 0 d， 7 d， and 14 d after cutting， and the anatomical observed by making paraffin sections. The dynamic changes of soluble sugar content， soluble protein content， lignin content， enzyme activity， and hormone levels were measured， and the rooting rate and number of roots were calculated after cutting 60 days.【Result】1） After cutting 14 days， adventitious roots were observed on the cuttings of 2-year-old C. henryi， while white protrusions appeared at the base of the cuttings of 8-year-old C. henryi. 2） The older the mother tree， the lower the rooting rate， and basal rejuvenation had no significant effect on the adventitious root formation of C. henryi cuttings （P > 0.05）. The rooting rates （68.0%， 70.0%） and the number of adventitious roots per cutting （11.3， 10.6） from 2-year-old control and its rejuvenated cuttings were significantly higher than those of 8-year-old control and its rejuvenated cuttings （3.2%， 4.4%） and the number of adventitious roots per cutting （3.2， 2.9） （P <0.05）. 3） The lignin content of 8-year-old cuttings was significantly higher than that of 2-year-old cuttings during the adventitious root formation （P < 0.05）， and rejuvenation did not reduce the lignin content of the cuttings. At 7 days， the soluble protein content of 8-year-old cuttings was significantly lower than that of 2-year-old cuttings in both control and rejuvenation treatments（P < 0.05）. 4） During the adventitious root formation process， the IAAO enzyme activity did not differ significantly among different ages and rejuvenated cuttings （P >0.05）； the IAA level of 8-year-old cuttings was significantly higher than that of 2-year-old cuttings（P < 0.05）. At 7 days， the SOD of 2-year-old C. henryi cuttings was significantly higher than that of 8-year-old cuttings （P < 0.05）， and the GA3 content of 8-year-old cuttings was significantly higher than that of 2-year-old cuttings （P < 0.05）.【Conclusion】Mother tree age is the main factor affecting the adventitious root formation of C. henryi cuttings， and simply basal rejuvenation treatments may not be suitable for increasing the adventitious rooting rate of adult C. henryi cuttings. Regulating the synthesis and metabolism pathways of lignin may be the key to improving the adventitious root formation of adult C. henryi cuttings.

Keywords： tree age； rejuvenation； adventitious root occurrence； Castanea henryi

锥栗Castanea henryi属于壳斗科Fagaceae栗属Castanea植物，是我国南方重要的木本坚果植物和重要的珍贵用材树种[1]。锥栗广泛分布于我国长江以南地区。其中，福建省、浙江省和湖南省为锥栗的主产区。2020年国家林业和草原局公布的数据显示，仅福建省就有锥栗人工栽培面积约80 000 hm2，年产量7.5万t，年产值数十亿元。大力发展锥栗产业对乡村振兴和生态文明建设均起到重要作用。目前，我国锥栗苗木繁殖方式主要为播种繁殖和嫁接繁殖[2-3]。播种繁殖使得锥栗进入结果期晚，且产量和品质参差不齐[4]；而嫁接繁殖虽能提早结实和保持母树的优良性状，但其操作技术复杂，人工成本较高，且嫁接后期存在不亲和、易感病等问题，严重限制了锥栗产业的健康发展[5]。扦插繁殖既可保持母树的优良性状，又具有育苗周期短、操作过程简单、繁育费用低等优势[6]，是加快锥栗产业发展的有效途径。

扦插繁殖的核心是诱导外植体产生不定根，从而发育成完整的植株。然而，不定根发生受遗传特性和外部环境等诸多因素影响[7-9]，其中年龄（尤其是木本植物）是最主要的限制因素[10-13]。一般来说，幼年期是无性繁殖采条的最佳时期[14]，而幼年林木表型性状不稳定，难以准确预测林木生长和结实特性。因而，一般在树木成龄后再去选择和繁殖更符合选种和测定的要求[15]。但成熟的扦插材料容易继承母株的年龄，从而导致插条成活率低等问题[16]。研究表明，复幼能有效克服成熟效应，提高成年插穗不定根的发生率[17]。复幼的方法有两类，一类是利用成年植株的幼年区；另一类则对成熟植株枝条进行强度修剪截干树冠以获得萌生枝[18]。姜英等[19]在成年黑荆树Acacia mearnsii上证实，通过截干后刺激萌发枝条，取萌发枝条进行扦插，发现5年生复幼后的半木质化萌芽枝的扦插成活率达到了41.3%；而采用5年生未经复幼处理的黑荆母树半木质化枝条进行扦插，其成活率为0。那么，这种复幼措施能否促进锥栗成年插穗不定根发生尚不清楚。

研究表明，可溶性糖、可溶性蛋白含量和抗氧化酶活性在插穗不定根发生过程中起着重要作用[20-25]。在其他木本植物（如白皮松Pinus bungeana、麻楝Chukrasia tabularis和菲油果Acca sellowiana）插穗不定根发生上的研究也表明生长素、赤霉素和脱落酸等植物激素在诱导根原基形成和不定根伸长方面具有重要调控作用[26-29]。然而，锥栗不同年龄及复幼后其插穗在不定根发生过程中的生理变化特征仍有待研究。

目前，关于母树年龄及其复幼措施对锥栗插穗生理及不定根发生的研究尚未见报道。因此，本研究以2年生、8年生锥栗实生母树为试材，经基部截干促萌复幼，对插穗基部进行生根解剖结构和形态观察，统计不同年龄和复幼插穗的生根率、生根数量，测定不定根发生过程中插穗的碳水化合物含量、木质素含量、内源激素水平和氧化酶活性变化，从解剖和生理学揭示锥栗成年母树限制其不定根发生的机制，探索锥栗成年母树复幼的关键技术措施，为锥栗良种繁殖提供理论和实践指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料及方法

1.1.1 试验材料

以2年生幼年和8年生成熟的锥栗且生长健壮、无病虫害的实生母树为试材（2 a对照、8 a对照），2年生苗木选择250株，8年生母树选择15株。于2023年1月，分别对2年生和8年生锥栗进行基部截干促萌复幼处理。具体如下：对2年生锥栗进行截干修剪（离地面20 cm处进行截干），共处理100株（2 a复幼）；对8年生锥栗进行截干修剪（离地面20 cm处进行截干），共处理12株（8 a复幼）。树干基部萌发出的幼嫩枝条即复幼材料，于2023年5月中旬进行扦插试验。试验材料分别来源于中南林业科技大学树木楼B座楼顶温室大棚和中南林业科技大学西园苗圃。

1.1.2 试验方法

穗条处理：于2023年5月15日，采集2年生和8年生锥栗萌发生长的半木质化穗条，修剪穗条长度为12 cm，插条剪口为“上平剪、下斜切”，靠近插条基部的叶子被移除，插入土壤的穗条顶部保留1～3片叶子，每片叶子保留1/2叶面积[30]。将插条置于20%多菌灵稀释10倍溶液中浸泡5～10 min，以防止病原真菌的感染。处理好的插条基部统一放在含有2 g/L吲哚-3-丁酸（IBA）（Sigma）的溶液中浸泡3～5 min后进行扦插。2 a复幼插穗和2 a对照插穗（不截干）各200个；8 a复幼插穗和8 a对照插穗（不截干）各350个。

扦插前基质的准备：供试基质为红壤[31]。扦插前一周，用50%多菌灵稀释10倍后均匀喷洒供试基质进行消毒，并用塑料薄膜覆盖，3 d后掀开薄膜，翻匀基质置于空地曝晒7 d。将制备好的基质装入培养穴盘（规格为50孔，长540 mm，宽280 mm，高105 mm）备用。

1.2 扦插管理

将处理好的穗条插入准备好的穴盘，插入深度为4～5 cm，扦插完成后，用喷壶进行雾状喷水，保持叶面湿润，盖上育苗箱。将扦插好的穴盘及时放入人工气候室培养（温度，25 ℃；湿度，80%；光照强度，22 000 lx；光照周期，14 h/d）。后续不定期喷水，保持湿度。

1.3 指标测定方法

1.3.1 生根指标的测定

扦插后60 d，随机取出10个插穗，每一株插穗为一个重复。将插穗的根部用清水冲洗干净，记录生根插穗数量，统计生根率、愈伤形成率、死亡率、平均不定根数，用直尺测量平均不定根长。

1.3.2 组织结构的观察

参照周乃富等[32]的方法，对插穗基部2～3 cm的茎段进行切片，并用OLYMPUS显微镜观察（Olympus SZX16，日本）并拍照。

1.3.3 生理指标的测定

在扦插后0、7、14 d，每个处理随机选取15个插穗作为样本。将插穗用蒸馏水冲洗干净后用滤纸擦干，迅速剪取插穗基部2～3 cm，剪碎混匀，经液氮冷冻后存于-80 ℃冰箱。将采集的样品进行液氮研磨。可溶性糖、可溶性蛋白、木质素含量和酶活性的测定称取0.1 g研磨后的样品，重复3次；内源激素的测定称取0.2 g样品，重复3次。

可溶性糖含量采用蒽酮比色法进行测定[33]。可溶性蛋白采用考马斯亮蓝比色法测定[34]。木质素含量的测定参考文献[35]。多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的测定参照《植物生理学实验技术》[36]。采购上海酶联生物科技有限公司的酶联免疫分析（ELISA）试剂盒检测IAA、GA3、ABA、ZR、IBA。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2016软件对原始数据进行处理，采用IBM SPSS statistics 26.0软件对数据进行显著性分析。不同处理之间试验参数显著差异性分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）中的邓肯检验（Duncan’test，P<0.05和P<0.01）。使用Origin 2019软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同树龄及复幼锥栗插穗生根表型、解剖结构观察及不定根发生率

扦插0 d各处理的解剖结构及其表皮、皮层、韧皮纤维、韧皮部、木质部和髓半径的厚度见图1。2 a和8 a插条的茎解剖结构在细胞类型和组织结构方面相似，8 a复幼锥栗插穗茎段髓半径和木质部细胞厚度分别为287.41、287.08 μm，8 a对照锥栗插穗茎段髓半径和木质部细胞厚度分别为347.41、341.65 μm，明显厚于2 a复幼锥栗插穗茎段髓半径和木质部细胞厚度（251.65、255.54 μm）和2 a对照锥栗插穗茎段髓半径和木质部细胞厚度（256.93、264.63 μm），锥栗不同年龄及对照、复幼的韧皮部、皮层和表皮的厚度之间无显著差异。

由图2可知，2 a锥栗嫩枝插穗在扦插14 d后，插穗叶子长势生长良好，插穗顶部有愈伤组织形成，插穗基部皮层有大量白色突起及不定根长出（图2A—B）；而8 a插穗叶子逐渐干枯，部分皮层有白色突起，部分插穗变黑，少部分插穗凋亡（图2C—D）。扦插60 d后2 a插穗出现大量不定根，白色突起更加明显（图2E—F）；8 a插穗有大量白色突起，少量不定根长出，大量插穗凋亡（图2G—H）。

扦插60 d后，对插穗进行生根率、愈伤形成率、死亡率、平均根长和平均根数进行统计，结果如表1所示。由表1可知，2 a对照锥栗插穗不定根发生率（68.0%）和每插穗不定根数量（11.3条）显著高于8 a对照插穗（3.2%，3.2条）（P<0.05）； 2 a插穗死亡率显著低于8 a插穗（P<0.05）；而2 a和8 a锥栗扦插复幼和对照在生根率、死亡率、每插穗不定根数量上均差异不显著。愈伤形成率和平均根长在各处理之间没有显著差异。

2.2 锥栗不同树龄及复幼插穗不定根发生过程中非结构性碳水化合物和可溶性蛋白含量变化

营养物质在生根过程中为插穗提供能量。对不同母树年龄插穗的研究结果表明，0～14 d锥栗插穗可溶性糖含量呈下降趋势，2 a插穗和8 a插穗之间无显著差异（图3A）；可溶性蛋白含量在扦插0 d时各处理之间无显著差异，扦插过程中2 a插穗呈先上升后下降的趋势，相反8 a插穗则是呈先下降后上升的趋势，扦插7 d后2 a插穗可溶性蛋白含量显著高于8 a插穗（P<0.05），扦插14 d后8 a插穗则显著高于2 a插穗（P<0.05）（图3B）；不同年龄锥栗插穗木质素含量在扦插过程中无显著变化，8 a插穗木质素含量显著高于2 a插穗（P<0.05）（图3C）。

对不同母树年龄进行复幼，结果表明，扦插0 d不同母树年龄的对照和复幼插穗之间可溶性糖含量差异不显著，扦插后7 d不同母树年龄对照插穗显著高于复幼插穗（P<0.05）（图3A）；扦插后0～7 d可溶性蛋白含量在不同母树年龄的对照和复幼之间无显著差异，扦插14 d 后8 a对照和复幼之间无显著差异，而2 a对照显著高于2 a复幼（P<0.05）（图3B）；扦插后0～14 d木质素含量表现为8 a复幼显著高于对照（P<0.05），而2 a插穗之间差异不显著（图3C）。

2.3 锥栗不同树龄及基部复幼插穗扦插过程中抗氧化酶活性变化

对不同年龄母树插穗的研究结果表明，扦插后0～14 d IAAO活性在各处理组之间无显著差异（图4A）；扦插后7～14 d不同年龄插穗之间POD、PPO活性无显著差异（图4B—C）；2 a插穗SOD活性整体呈现下降趋势，8 a插穗则呈先下降后上升的趋势，扦插7 d后2 a插穗SOD活性显著高于8 a插穗（P<0.05）（图4D）。

对不同母树年龄的复幼研究结果表明，扦插0～14 d IAAO活性在不同母树年龄的对照和复幼之间无显著差异（图4A）；不同母树年龄复幼的POD活性呈先上升后下降的趋势，而不同母树年龄对照则呈相反趋势，且扦插7 d不同年龄复幼与对照之间差异显著（P<0.05）（图4B）；在扦插0 d 2 a对照插穗PPO活性显著高于其复幼插穗（P<0.05），8 a复幼插穗PPO活性显著高于其对照插穗（P<0.05），而扦插7～14 d相同年龄不同处理插穗之间无显著差异（图4C）；扦插0 d不同母树年龄的复幼和对照之间SOD活性无显著差异，而7 d时8 a复幼插穗SOD活性显著低于其对照（P<0.05）（图4D）。

2.4 锥栗不同树龄及复幼插穗不定根发生过程中内源激素含量变化

对不同母树年龄插穗的研究结果表明，ABA含量在7 d时2 a插穗与8 a插穗之间有显著差异（P<0.05）（图5A）；0～14 d时8 a插穗IAA 含量显著高于2 a插穗（P<0.05），且7 d时2 a插穗IAA 含量最低（图5 B）。ZR含量在0～14 d时2 a插穗与8 a插穗之间无显著差异（图5C）。在扦插过程中2 a插穗的GA3含量整体呈现上升趋势，而8 a插穗则是“上升—下降”的趋势，7 d时8 a插穗达到峰值，且显著大于2 a插穗（P<0.05）（图5D）；0～14 d时2 a插穗IBA含量整体呈上升趋势，而8 a插穗呈现“上升—下降”的趋势，7 d时达到峰值（图5E）。

对不同母树年龄的复幼研究结果表明，ABA含量在扦插生根过程中不同母树年龄复幼插穗整体呈现下降趋势，7 d时2 a插穗之间无显著差异，而8 a复幼插穗显著高于其对照插穗（P<0.05），14 d时不同母树年龄对照显著高于复幼（P<0.05）（图5A）；0 d时2 a复幼插穗IAA含量显著高于2 a对照插穗（P<0.05），而7 d时8 a对照插穗IAA 含量显著高于其复幼插穗（P<0.05），相反2 a对照插穗显著低于其复幼插穗（P<0.05），14 d时不同母树年龄复幼插穗IAA含量分别显著大于其对照插穗（P<0.05）（图5B）；0 d时2 a对照插穗ZR含量显著高于其复幼插穗，而8 a复幼插穗显著大于其对照插穗（P<0.05）（图5C）；0 d时8 a对照插穗GA3含量显著高于其复幼插穗（P<0.05），而2 a插穗之间无显著差异，7 d时不同母树年龄复幼插穗显著高于其对照插穗（P<0.05）（图5D）；0 d时IBA含量在不同母树年龄对照和复幼插穗之间无显著差异，7～14 d时8 a复幼插穗IBA含量显著高于其对照插穗（P<0.05），相反7 d时2 a对照插穗显著高于其复幼插穗（P<0.05）（图5E），而14 d时两者之间无显著差异。

3 讨 论

3.1 母树年龄对不定根发生的影响

扦插14 d后2 a插穗开始有不定根出现，且2 a对照锥栗插穗不定根发生率（68.0%）和每插穗不定根数量（11.3条）显著高于8 a对照插穗（3.2%；3.2条），插穗不定根发生率随母树年龄增大而降低。这与前人在板栗C. mollissima和日本落叶松Larix kaempferi等木本植物上的研究结果一致[37-40]。相较于幼年插穗，成年插穗不定根发生困难的生理原因一直备受关注，其中生根抑制物的存在和以生长素为主的内源激素的合成和代谢被认为起主要作用[41-43]。本研究发现，在扦插 7 d时2 a插穗内可溶性蛋白含量增加，且显著高于8 a插穗。对杜仲Eucommia ulmoides嫩枝扦插的研究也证明了插穗自身的应急机制会产生大量的蛋白酶类物质，参与大分子营养物质的水解代谢，可溶性蛋白含量增加[44]。8 a插穗木质素含量和木质部厚度显著高于2 a插穗，且复幼不能降低插穗木质素含量和木质部厚度。对古侧柏成年插穗不定根发生的研究也证明了愈伤组织的木质化是导致其不定根发生困难的原因之一[45]。因此，通过抑制成年插穗木质素合成可能是提高其不定根发生的途径。此外，本研究中8 a插穗的IAA水平显著高于2 a插穗，且复幼并未改变这一规律；同时，8 a复幼插穗的IBA含量显著高于其他处理，IAAO酶活性在不同母树年龄和复幼处理间均无显著差异，这与在欧洲栗C. sativa上的研究结果类似，说明生长素缺乏并不是导致木本植物成年插穗不定根发生的主要限制因子[46]。但对苹果Malus pumila砧木的不定根发生的研究表明，年龄途径和生长素信号的相互作用共同调控了多年生木本植物的不定根发生[47]，而锥栗成年插穗的不定根发生机理是否与苹果相同有待进一步研究。

3.2 复幼措施对插穗不定根发生的影响

基部修剪促萌复幼措施在提高云杉Picea asperata和松树的成年插穗不定根发生能力上效果显著，且广泛应用于生产[48-49]。但本研究结果表明，基部修剪促萌复幼措施并不能显著提高锥栗嫩枝扦插不定根发生率，8 a锥栗插穗复幼前后措施生根率分别为3.2%和4.4%，均显著低于2 a锥栗插穗生根率，且2 a锥栗复幼前后也无显著差异。造成这一现象的原因可能有：一是锥栗成年母树的养分不足，特别是P水平低，这与其生长在典型的酸性红壤环境有关。有研究表明，施P肥可增加橄榄树Olea european母树插穗的不定根发生能力[50]。因此，增加锥栗母树P水平可能是提高其插穗不定根发生能力的一个有效途径。二是锥栗成年母树的光照强度弱。本试验锥栗母树萌条生长时期（3—5月）正值湖南长沙降水量较多的季节（雨天占50%，且降水量达400 mm，数据来源：https：//en.tutiempo.net/climate/03-2023/ws-576870. html），光照强度低，导致穗条光合产物积累少，抑制了插穗不定根发生[51-53]。三是复幼方法不适宜。以油松Pinus tabulaeformis为试验材料的研究结果表明，DAL1和MADS11这两个年龄标志基因在根茎处表达量最低，离地面越高其表达量越高[54]，因此，多数用材树种（杨树、松树和桉树等）采用基部截干促萌复幼的方式，效果较好。但以壳斗科为主的难生根树种的年龄与不定根发生能力之间的互作机制可能与此不同。

4 结 论

综上，本研究以2年生和8年生锥栗母树为材料，分别进行基部截干促萌复幼处理，以当年生半木质化的新枝为试材，以不截干枝条为对照，进行扦插试验。对生根过程中插穗基部的营养物质、内源激素、木质素和解剖机构观察等生理生化指标的动态变化进行分析，从生理变化和解剖结构方面对锥栗扦插进行初步探讨。结果表明，母树年龄是影响锥栗插穗不定根发生的主要要素，单纯的基部平茬促萌复幼措施可能不适宜被用来提高锥栗成年插穗的不定根发生率，针对栗属难生根树种的复幼措施仍有待探究。调控木质素的合成和代谢可能是提高锥栗成年插穗不定根发生的关键。

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[本文编校：谢荣秀]