PGC-1α/Nrf1介导的线粒体生物合成通路在H2O2诱导的心肌细胞衰老中的作用机制

【摘要】目的 探究PGC-1α/Nrf1介导的线粒体生物合成通路在H2O2诱导的心肌细胞衰老中的作用及可能机制。方法 培养H9c2心肌细胞，根据实验设计分为对照组、衰老组、PGC-1α激活组，Western blotting检测心肌细胞中p21、p53、PGC-1α、Nrf1的蛋白水平，RT-qPCR检测心肌细胞中p21、p53、PGC-1α、Nrf1的mRNA水平，免疫荧光染色检测p53与PGC-1α共表达水平，试剂盒检测心肌细胞中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）及腺苷三磷酸（ATP）水平，线粒体膜电位（ΔΨm）检测试剂盒检测ΔΨm。结果 与对照组相比，衰老组心肌细胞中衰老标志蛋白p21、p53蛋白及mRNA水平增加，线粒体生物合成通路蛋白PGC-1α、Nrf1蛋白及mRNA水平减少；与衰老组相比，PGC-1α激活组p21、p53蛋白及mRNA水平减少，PGC-1α、Nrf1蛋白及mRNA水平增加（P均<0.05）。与对照组相比，衰老组心肌细胞SOD、GSH含量减少，MDA、ROS含量增加，细胞ΔΨm下降，ATP含量减少；与衰老组相比，PGC-1α激活组SOD、GSH含量增加，MDA、ROS含量减少，ΔΨm增加，ATP含量增加（P均<0.05）。结论 PGC-1α/Nrf1介导的线粒体生物合成通路在H2O2诱导的心肌细胞衰老中发挥重要作用，激活PGC-1α/Nrf1通路可通过改善氧化应激水平改善心肌细胞的衰老。

【关键词】心肌细胞；衰老；p21；p53；PGC-1α/Nrf1通路；线粒体

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.10.017

The Role of PGC-1α/Nrf1 Mediated Mitochondrial Biosynthesis Pathway in H2O2-Induced Cardiomyocyte Senescence

TIAN Wei，RAO Xiaojiao，GAO Meng，XIAO Shu’na

（Cardiovascular Center，Liyuan Hospital， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430000，Hubei，China）

【Abstract】Objective To investigate the role of PGC-1α/Nrf1 mediated mitochondrial biosynthesis pathway in H2O2-induced cardiomyocyte senescence and its possible mechanism.Methods H9c2 cardiomyocytes were cultured and divided into control group，senescence group and PGC-1α activated group according to the experimental design.Western blotting detected the protein levels of p21，p53，PGC-1α and Nrf1 in the cardiomyocytes.The mRNA levels of p21，p53，PGC-1α and Nrf1 in cardiomyocytes were detected by RT-qPCR，co-expression levels of p53 and PGC-1α were detected by immunofluorescence staining，superoxide dismutase （SOD），glutathione （GSH），malondialdehyde （MDA），reactive oxygen species （ROS） and adenosine triphosphate （ATP） levels in cardiomyocytes were detected by kits.Mitochondrial membrane potential （ΔΨm） test kit was used to detect ΔΨm.Results Compared with the control group，the levels of senescence marker proteins p21 and p53 protein and mRNA in senescence group were increased，mitochondrial biosynthesis pathway proteins PGC-1α，Nrf1 protein and mRNA levels decreased.Compared with senescence group，the levels of p21 and p53 protein and mRNA in PGC-1α activated group were decreased，PGC-1α，Nrf1 protein and mRNA levels increased（All P<0.05）.Compared with control group，SOD and GSH contents of cardiomyocytes in senescent group decreased，MDA and ROS contents increased，cell ΔΨm decreased，ATP content decreased.Compared with senescence group，the contents of SOD and GSH in PGC-1α activated group were increased，MDA and ROS contents decreased，ΔΨm increased，ATP content increased（All P<0.05）.Conclusion PGC-1α/Nrf1 mediated mitochondrial biosynthesis pathway plays an important role in H2O2-induced cardiomyocyte senescence，activation of PGC-1α/Nrf1 pathway can improve the senescence of cardiomyocytes by improving the level of oxidative stress.

【Keywords】Cardiac muscle cell；Senescence；p21；p53；PGC-1α/Nrf1 pathway；Mitochondrion

心脏衰老是心脏储备功能下降的一种情况，其中，心肌细胞衰老参与心血管疾病的病理机制［1］。心血管疾病是影响人类生活的主要危险因素，也是导致人类死亡的主要原因之一。由于缺乏有效的治疗靶点逆转病理性心脏损伤，所以改善衰老心脏的功能至今仍是一大难题［2］。因此，充分了解心脏衰老机制至关重要。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α，PGC-1α）是线粒体生物发生的主要调节因子，也是调节抗氧化的核心蛋白［3］。Li等［4］研究表明，核转录因子红系2相关因子1（nuclear factor-erythroid 2-related factor 1，Nrf1）可与PGC-1α协同转录促进线粒体生物合成发生，并参与感染导致的心脏损伤过程。p21与p53是重要的衰老相关蛋白，在心肌细胞衰老中发挥重要作用［5-6］。Wang等［7］研究显示激活SIRT1/PGC-1α通路可降低活性氧（reactive oxygen species，ROS），改善心肌细胞衰老。然而，关于PGC-1α介导的线粒体生物合成通路在衰老心肌细胞中与p21、p53之间的可能联系机制尚未完全阐明。此外，越来越多研究［8］表明，氧化应激诱导的心肌细胞损伤在心肌细胞衰老中占据重要地位。本研究通过使用H2O2建立心肌细胞衰老模型，探究PGC-1α/Nrf1通路与衰老标志蛋白p21、p53之间的可能联系，为治疗心脏衰老提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

p21抗体、p53抗体（美国sigma公司），PGC-1α抗体、Nrf1抗体（美国abcam公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒、线粒体膜电位

（mitochondrial membrane potential，ΔΨm）检测试剂盒（JC-1，赛默飞世尔科技公司），丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒、ROS检测试剂盒、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）检测试剂盒（索莱宝生物科技有限公司），PGC-1α激活剂ZLN005（美国MCE公司），荧光定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）仪（加拿大Funglyn Biotech），全自动酶标仪（赛默飞世尔科技公司）。

1.2 实验分组与衰老细胞模型的建立

培养大鼠H9c2心肌细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司），根据实验设计分为：对照组、衰老组、PGC-1α激活组。对照组细胞置于37 ℃培养箱中正常培养，衰老组、PGC-1α激活组心肌细胞加入H2O2（100 μmol/L）培养4 h，PGC-1α激活组在加入H2O2之前2 h加入PGC-1α激活剂ZLN005 20 μmol/L。

1.3 RT-qPCR检测心肌细胞中p21、p53、PGC-1α、Nrf1的mRNA水平

提取大鼠心肌细胞中总RNA量，逆转录p21、p53、PGC-1α、Nrf1的RNA为互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）。扩增p21、p53、PGC-1α、Nrf1的cDNA，内参为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH），引物序列见表1。

1.4 Western blotting 检测心肌细胞中p21、p53、PGC-1α、Nrf1的蛋白表达

收集各组大鼠心肌细胞，加入合适的裂解液提取总蛋白，检测各组蛋白浓度，配置成一定体系后将蛋白高温变性。配置合适浓度的凝胶，向凝胶孔道中加入相同体积的样品进行电泳，将电泳结束的凝胶与聚偏二氟乙烯膜按照一定顺序置于转膜夹中进行转膜。转膜后浸入快速封闭液中封闭，磷酸盐吐温缓冲液清洗后，分别孵育p21、p53、PGC-1α、Nrf1一抗，再孵育对应的二抗，磷酸盐吐温缓冲液清洗后使用发光液曝光，最后将结果保存后统计分析。

1.5 试剂盒检测心肌细胞中SOD、GSH、MDA、ROS及ATP水平

收集各组大鼠心肌细胞，分别按照SOD活性检测试剂盒、MDA检测试剂盒、GSH检测试剂盒、ROS检测试剂盒、ATP检测试剂盒说明书中的实验步骤进行操作，最后根据提供的公式进行统计分析。

1.6 免疫荧光染色检测心肌细胞中p53、PGC-1α蛋白表达

待心肌细胞长满后制备成细胞悬液，稀释后加入6孔板，待孔板中细胞长满后使用磷酸盐缓冲溶液清洗3次，使用多聚甲醛固定25 min，0.5％TritonX-100打孔5 min，封闭液封闭30 min，加入稀释好的抗体，置于4 ℃冰箱过夜。第二天使用磷酸盐缓冲溶液清洗后加入稀释好的二抗（避光），最后加入含4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的封片剂，8 min后，在荧光显微镜下观察分析。

1.7 ΔΨm检测试剂盒检测ΔΨm

将各组心肌细胞培养在12孔板中，待长至80%时进行干预，按照ΔΨm检测试剂盒说明书中的实验步骤进行操作，最后在荧光显微镜下观察并统计分析。

1.8 统计学处理

采用SPSS 23.0软件进行数据分析，所有计量数据均以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 激活PGC-1α对衰老心肌细胞衰老标志蛋白p21、p53表达的影响

与对照组相比，衰老组心肌细胞中衰老标志蛋白p21、p53蛋白水平增加（P<0.05）；与衰老组相比，PGC-1α激活组p21、p53蛋白水平减少（图1A和1B，P<0.05）。与对照组相比，衰老组心肌细胞中p21、p53 mRNA水平增加（P<0.05）；与衰老组相比，PGC-1α激活组p21、p53 mRNA水平减少（图1C，P<0.05）。

2.2 激活PGC-1α对衰老心肌细胞线粒体生物合成通路蛋白PGC-1α、Nrf1表达的影响

与对照组相比，衰老组心肌细胞中线粒体生物合成通路蛋白PGC-1α、Nrf1蛋白水平减少（P<0.05）；与衰老组相比，PGC-1α激活组PGC-1α、Nrf1蛋白水平增加（图2A和2B，P<0.05）。与对照组相比，衰老组心肌细胞中PGC-1α、Nrf1 mRNA水平减少（P<0.05）；与衰老组相比，PGC-1α激活组PGC-1α、Nrf1 mRNA水平增加（图2C，P<0.05）。

2.3 激活PGC-1α对衰老心肌细胞p53及PGC-1α共表达水平的影响

免疫荧光检测结果显示，与对照组相比，衰老组心肌细胞中p53蛋白表达增加的同时，PGC-1α蛋白表达减少（P<0.05）；与衰老组相比，PGC-1α激活组心肌细胞中p53蛋白表达减少的同时，PGC-1α蛋白表达增加（图3A和3B，P<0.05）。

2.4 激活PGC-1α对衰老心肌细胞氧化应激水平的影响

与对照组相比，衰老组心肌细胞SOD、GSH含量减少（P<0.05），MDA、ROS含量增加（P<0.05）；与衰老组相比，PGC-1α激活组SOD、GSH含量增加（图4A和4B，P<0.05），MDA、ROS含量减少（图4C和4D，P<0.05）。

2.5 激活PGC-1α对衰老心肌细胞ΔΨm及ATP的影响

与对照组相比，衰老组心肌细胞ΔΨm下降（P<0.05），ATP含量减少（P<0.05）；与衰老组相比，PGC-1α激活组ΔΨm增加（P<0.05），ATP含量增加（图5A～5C，P<0.05）。

3 讨论

衰老是心血管疾病的危险因素之一。最近的研究［9］表明，心脏衰老的发病机制与心血管疾病直接相关，如心力衰竭。心血管疾病（如心力衰竭）患者的生活质量较低，死亡率较高［10］。由于心肌细胞的不可再生性，绝大多数与衰老相关的心血管疾病患者无法避免疾病复发［11］。因此，进一步研究心肌细胞衰老的机制和抑制心肌细胞衰老发展的策略将有利于提高患者的生活质量。近年来，大量研究［8］表明，氧化应激是心肌细胞衰老损伤的一种主要途径。因此，抑制心肌细胞氧化应激反应对预防衰老诱发的心血管疾病至关重要。本研究利用H2O2构建心肌细胞衰老模型，结果显示，与正常心肌细胞相比，衰老组的心肌细胞中MDA、ROS含量增加，GSH、SOD含量减少，即衰老心肌细胞的氧化能力增强，抗氧化能力降低，衰老相关蛋白p53、p21表达显著增加。

PGC-1α/Nrf1通路可调控线粒体的生物合成过程改善心肌细胞肥大［12］。Yeo等［13］研究表明，高表达PGC-1α可改善老年骨骼肌中线粒体缺陷。沉默信息调控因子1是细胞能量的代谢传感器，对能量代谢、氧化应激反应、衰老起重要作用，沉默信息调控因子1可去乙酰化PGC-1α参与线粒体生物合成［14］。此外，研究［7］显示，亚精胺可通过激活PGC-1α/Nrf2通路延缓心脏衰老。Lee等［15］研究表明，激活PGC-1α/Nrf2信号通路可通过抗氧化作用缓解H2O2及紫外线引起的皮肤衰老。这提示，PGC-1α/Nrf2通路介导的线粒体生物合成在心肌细胞衰老中发挥重要作用。既往研究［5］显示，p21与p53的激活可促进心肌细胞衰老。然而，目前关于PGC-1α介导的线粒体生物合成通路在衰老心肌细胞中与p21、p53之间可能的联系机制尚未完全阐明。本研究结果显示，衰老心肌细胞中PGC-1α/Nrf1通路蛋白表达下降，ΔΨm下降，ATP水平降低，衰老相关蛋白p21、p53表达增加，激活PGC-1α后PGC-1α/Nrf1通路蛋白表达、ΔΨm、ATP水平、抗氧化因子SOD和GSH水平增加，氧化因子ROS、MDA水平减少，衰老相关蛋白p21、p53表达减少。

综上所述，本研究初步阐明PGC-1α/Nrf1介导的线粒体生物合成通路在H2O2诱导的心肌细胞衰老中发挥着重要作用，激活该通路可下调氧化应激水平及衰老相关蛋白的表达，这将为治疗心肌细胞衰老提供新的理论依据。然而，关于PGC-1α/Nrf1通路与衰老相关蛋白p21、p53之间深入的分子机制仍有待继续挖掘。

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基金项目：湖北省卫生健康委员会科研项目（20220108）

通信作者：肖书娜，E-mail：qingqing200199@163.com