CDHR2 过表达通过抑制PI3K/Akt 通路抑制乳腺癌细胞增殖

摘要：目的 研究CDHR2 通过PI3K/Akt 信号通路抑制乳腺癌细胞生长和细胞周期的作用机制。方法 利用生物信息学分析CDHR2在乳腺癌中的表达及生存预后情况，并利用免疫组化验证，采用qRT-PCR、Western blot检测5株乳腺癌细胞株与正常乳腺上皮细胞中CDHR2的表达，并分析CDHR2的表达情况。筛选出CDHR2表达量低的乳腺癌细胞系MDA-MB-231及MCF7进行质粒转染过表达CDHR2，分为NC组（空白质粒对照）和CDHR2组（CDHR2质粒过表达组）。利用CCK-8增殖实验、EdU增殖实验及细胞周期实验探究CDHR2 对乳腺癌细胞生长和细胞周期的影响，通过Western blotting 检测CDHR2 过表达对PI3K/Akt信号通路和周期通路蛋白表达的影响。结果 生物信息学分析显示在乳腺癌及癌旁中CDHR2表达量均较低且两者间差异无统计学意义（Pgt;0.05），但高表达CDHR2乳腺癌患者预后更好（Plt;0.05）。免疫组化、qRT-PCR及Western blot实验提示，CDHR2在乳腺癌组织及乳腺癌细胞中表达均显著下调（Plt;0.01），CDHR2可以抑制乳腺癌细胞增殖及阻滞乳腺癌细胞的细胞周期（Plt;0.01），CDHR2能够抑制PI3K和Akt磷酸化蛋白表达、抑制周期蛋白Cyclin D1的表达。结论 过表达CDHR2可能通过PI3K/Akt信号通路抑制乳腺细胞生长及阻滞乳腺癌细胞的细胞周期。

关键词：乳腺癌；CDHR2；PI3K/Akt 通路；增殖；细胞周期

乳腺癌已超过肺癌成为世界上最常见的癌症和第五大癌症死亡原因［1］，尽管乳腺癌的治疗理念随着医学对肿瘤的不断深入认识而逐渐提高，但乳腺癌的发病机制至今仍不明确，乳腺癌患者的长期生存率也不理想。乳腺癌患者根据不同的激素受体表达情况可进分为luminal A、luminal B、HER-2 过表达型以及三阴型4 种类型乳腺癌。对于乳腺癌患者而言，保乳手术、乳腺癌改良根治术和放疗是最常见的治疗方法。同时，还可根据乳腺癌的分期、分子分型、淋巴结分期等进行个体化化疗、靶向治疗和激素治疗等全身性辅助治疗［2］。但目前的临床治疗存在一定局限性，比如激素受体阳性乳腺癌患者存在内分泌耐药且复发率较高等问题，人类表皮生长因子受体2（ HER2）阳性型存在靶向治疗耐药［3］，三阴性乳腺癌患者的早期复发转移率较高，且靶标部位不明确，肿瘤异质性强，患者只能选择化疗。由于不同的乳腺癌亚型在基因表达模式、治疗策略的选择以及对治疗的反应和预后等方面存在差异。因此，为进一步了解乳腺癌的发病机制，改进治疗方法和延长生存期。寻找理想的靶点和新型生物标志物对于早期诊断、改善预后和开展肿瘤分子靶向治疗具有重要意义［4］。

钙粘蛋白相关家族成员2（CDHR2）也被命名为PCDH24属于原钙粘蛋白家族，PCDH家族在钙依赖性细胞粘着中扮演重要角色［5］。在许多人类癌症（包括乳腺癌，白血病，胃癌，结直肠癌，食道癌和肺癌）中已经报道了一些PCDH家族成员（例如PCDH8，PCDH9，PCDH10，PCDH17 和PCDH20）的表达丧失［6-9］，表明 PCDH可以作为人类癌症的肿瘤抑制剂，但目前CDHR2在乳腺癌中尚未有研究。本研究通过阐明CDHR2 抑制PI3K/Akt通路抑制乳腺癌细胞的生长，并进一步阻滞乳腺癌细胞周期，有望为乳腺癌治疗提供新靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

选取南方医科大学中西医结合医院手术切除的10例乳腺癌组织及其相应癌旁正常组织，纳入标准：初次确诊为乳腺癌；治疗前未进行放疗、化疗及免疫治疗。本研究通过南方医科大学中西医结合医院伦理委员会批准（伦理审批号：2022-070）。MCF10A、MDAMB-231、MCF7、HCC1937、T47D和SKBR3 细胞系均由南方医科大学中西医结合医院中心实验室保存。

主要试剂：PBS 粉末、Tween20/TBS 溶液（20×TBST，北京雷根公司）；RIPA蛋白裂解液（Strong）、蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂（康为世纪公司）；RPMIDMEM培养基（Biological Industries）；MCF10A细胞专用培养基（武汉普诺塞公司）；南美源胎牛血清（上海微科公司）；Lipofectamine 2000 转染试剂（Invitrogen）；PAGE 凝胶快速制备试剂盒、蛋白预染Marker、ECL发光显影剂（上海雅酶公司）；PVDF 膜（Millipore）；RNA提取试剂盒（FOREGENE），细胞周期检测试剂盒购自Dojindo（日本同仁化学）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析

本研究采用GEPIA 数据库（http： //gepia.cancer-pku.cn/）对CDHR2 在乳腺癌组织和正常乳腺上皮组织中表达情况进行对比，通过两独立样本t检验分析两组间表达差异情况，样本量包括癌组织1085 例，正常组织112 例。利用Kaplan-MeierPlotter （https：//kmplot.com）对CDHR2 与乳腺癌预后的关系进行分析。使用STRING（https：//cn.string-db.org）对CDHR2与PI3K、AKT、CCND1及其他可能存在的蛋白进行相互结合作用预测，网站参数设置：Homosapiens，confidence（0.15）。

1.2.2 免疫组化

将组织切片置于烤箱60 ℃烘烤120 min，经二甲苯及梯度浓度酒精脱蜡脱水后，向切片滴加适量3% H2O2以阻滞内源性过氧化物酶，室温静置15 min，去离子水洗3次，柠檬酸钠抗原修复液高温处理8 min，于室温条件下自然冷却，室温下山羊血清封闭30 min，加入CDHR2 抗体（1∶2000）4 ℃处理下过夜。PBS清洗3次，将组织切片与带有HRP结合的二抗孵育30 min，DAB显影，细胞核用苏木素进行染色，免疫组化评分：染色强度分为0～3分，阴性0分，弱阳性1分，阳性2分，强阳性3分。染色范围1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分，最终评分=染色强度评分×染色范围评分。

1.2.3 细胞培养

乳腺上皮细胞MCF10A使用专用完全培养基培养，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF7、HCC1937、T47D、SKBR3 均使用含10% 胎牛血清的RPMI DMEM培养，将细胞放置在37 ℃、5%CO2条件下静置培养。每3 d 传代1 次，当细胞生长状态良好、处于对数生长期时，用胰酶消化、离心后使用培养基重悬得到单细胞悬液，然后根据实验需要对细胞进行后续实验。

1.2.4 qRT-PCR

取对数生长期细胞，提取实验细胞中总RNA，检测浓度和纯度合格后取2 μg RNA逆转录合成cDNA，根据试剂盒说明书进行PCR扩增。利用相对量化方法，通过比较2-ΔΔCt来计算基因的倍数变化，将GAPDH作为内参。引物从生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列：GAPDH 正向引物CAATGACCCCTTCATTGACC；GAPDH 反向引物GACAAGCTTCCCGTTCTCAG；CDHR2 正向引物CCCCGAAGTTCCTAGCCAAC；CDHR2 反向引物GTCTTCCGCTACCAACCAGA。

1.2.5 Western blot 实验

计算所提取细胞蛋白含量30 μg，以3∶1 的比例蛋白与上样缓冲液4×SDS进行混合，置于95 ℃金属浴锅10 min后放置于冰上2 min。制胶后进行SDS-PAGE 电泳，使其在80 V 电压下保持30 min，而分离胶在120 V下保持90 min。转膜采用湿式转膜法至PVDF膜。置于含有5% BSA的 TBST密封液的平板中，于室温下培养1 h。将一抗用封闭剂稀释，于室温孵育1 h，4 ℃孵育1夜。TBST 洗膜3次，5 min/次。孵育二抗1 h后，TBST洗膜3次，5 min/次，即可加入ECL显色试剂显影拍照记录。CDHR2多克隆抗体（1∶1000）、GAPDH单克隆抗体（1∶50 000）、Akt S473 单克隆抗体（1∶1000）、Cyclin D1 多克隆抗体（1∶5000）、β-Tubulin多克隆抗体（1∶12 000），PI3K T458多克隆抗体（1∶1000，CST）。

Western blotting灰度值分析选用Image J软件协助定量分析，对所有条带进行灰度测定后，获得对应研究基因和内参的区域像素值之和，以研究基因/内参基因之比。最后将目的蛋白灰度值除以内参蛋白的灰度值，进行归一化处理。

1.2.6 细胞转染

通过上海吉凯公司订购CDHR2过表达质粒，当MCF-7 和MDA-MB231 细胞处于对数生长期、细胞状态良好时，消化MCF-7 和MDA-MB231 细胞，进行细胞计数；向六孔板各孔中接种5×105个细胞；转移培养皿至恒温培养箱（37 ℃，5% CO2）。待细胞贴壁后按照Lipofectamine ™2000 转染说明书转染至MCF-7和MDA-MB231细胞。将处理后的细胞分别为对照组（NC组）及过表达CDHR2组（CDHR2组），转染六孔板放至恒温37 ℃，5% CO2培养箱放置6～8 h 后更换新的完全培养基，细胞转染48 h后，可收集瞬时转染的细胞进行Western blotting实验及其他功能试验。

1.2.7 CCK-8实验

CCK8试剂盒购自南京诺唯赞生物公司，将MDA-MB-231 及MCF7 细胞离心计数接种于96孔板中，2000个细胞每孔，在贴壁后0、24、48、72、96 h检测细胞活力。然后每孔加CCK8试剂10 uL，在37 ℃培养箱继续培养2 h，用酶标仪在450 nm处测定各孔的吸光度（A），A值反映了肿瘤细胞的增殖能力。每组重复3次实验，取平均值，记录生长曲线。

1.2.8 EdU实验

采用锐博的Edu 试剂盒进行检测，首先以1∶1000比例对Edu溶液（试剂A）进行稀释，用细胞培养基将其配制为50 μmol/L Edu培养基；在37 ℃恒温培养箱孵育2 h，去除细胞中的培养基；用PBS对细胞进行清洗，每次清洗5 min，清洗3次；在每孔中添加50 μL细胞固定液（即PBS中含有4%的POM），在室温下孵育30 min，去除固定液；添加50 μL 2 mg/mL甘氨酸，在脱色摇床温养5 min，然后丢弃甘氨酸（用于中和的聚甲醛）；在每孔中再添加100 μL的PBS，洗涤5 min 的脱色摇床，将PBS 除去；在每孔中添加100 μL 渗透剂（PBS，0.5%Trition-X-100），在脱色摇床孵育10 min，然后用PBS 洗涤5 min 1 次；在每孔中添加100 μL 的Apollo染色剂，避光，在脱色摇床室温育20 min，弃染；添加100 μL渗透剂（PBS，0.5%Trition-X-100），在脱色器中洗涤2～3次，每次10 min，除去渗透剂；在每个孔中添加DAPI 100 μL，在光照下，在脱色摇床室温育5 min，除去染色反应溶液；每孔用100 μL PBS冲洗。

1.2.9 流式细胞术检测细胞周期

细胞从培养箱中取出，PBS洗3遍；加胰酶消化，加含有血清的培基终止消化；移入离心管中静置，离心lt;500 r/min，弃上清； 将细胞重新悬浮在0.5 mL 1×PBS 中，并快速注入3.5 mL70%预冷乙醇中搅拌，室温4 ℃保存1夜，次日将经乙醇提取的细胞进行离心，弃去上清，用1×PBS冲洗3次，除去残余酒精。应用含有0.2 mg RNase A 的1 mL PI/Triton X-100染色液（20 μg PI/0.1% Triton X-100）重悬细胞，37 ℃ 染色15 min。应用流式细胞仪BDFACSCalibur测定细胞周期。

1.2.10 统计学方法

本研究用 SPSS 统计24.0 和GraphPad Prism9.0进行绘图，计量资料以均数±标准差表示，使用两独立样本t检验进行两组间的比较，单因素方差分析用于比较多组数据的差异，生存曲线用Logrank比较，Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDHR2在乳腺癌患者中的表达及生存预后

通过TCGA数据集对CDHR2表达进行分析，结果显示在乳腺癌及癌旁中CDHR2 表达量均较低且两者间差异无统计学意义（Pgt;0.05，图1），Kaplan-MeierPlotter在线数据分析CDHR2在乳腺癌患者中的生存预后，发现在三阴型、luminal A型、luminal B型、Her2过表达型乳腺癌患者中，CDHR2高表达患者预后更好，其中CDHR2 过表达的三阴型、luminal A型、luminal B型乳腺癌患者，其总生存期（OS）均高于低表达CDHR2 的乳腺癌患者（Plt;0.05，图2）。免疫组化显示CDHR2蛋白在乳腺癌组织中表达明显下调（图3，Plt;0.0001）。

2.2 CDHR2在乳腺癌细胞系及正常人乳腺上皮细胞中的表达水平

qRT-PCR结果显示CDHR2 在乳腺癌细胞系中表达较正常人乳腺上皮细胞MCF10A相比显著下降，差异有统计学意义（Plt;0.01，图4）。Western blotting检测结果提示，CDHR2在乳腺癌细胞中，尤其是在MDA-MB-231、MCF7细胞中表达水平较低（图5）。

2.3 过表达CDHR2转染结果验证

选取MDA-MB-231及MCF7两株细胞进行实验，首先过表达质粒转染乳腺癌细胞系，qRT-PCR测定转染细胞中CDHR2的表达量，在乳腺癌细胞系MDA-MB-231 及MCF7 中，CDHR2 的表达量要远高于对照组（Plt;0.001，图6）。

2.4 过表达CDHR2抑制乳腺癌细胞增殖

CCK8实验结果显示在MDA-MB-231及MCF7细胞中，CDHR2 高表达组在第3、4、5 天的增殖活力显著降低（Plt;0.01，图7）。相较于对照组，CDHR2过表达组MDA-MB-231 及MCF7细胞中的S期细胞比例显著减少（Plt;0.01，图8）。

2.5 过表达CDHR2抑制乳腺癌细胞的细胞周期

流式细胞术结果显示，过表达CDHR2基因能使细胞周期阻滞在G0/G1期，且过表CDHR2后乳腺癌细胞的S期细胞比例明显减少，最终改变乳腺癌细胞增殖能力，差异具有统计学意义（Plt;0.01，图9）。

2.6 CDHR2 通过PI3K/Akt 通路抑制乳腺癌细胞生长和细胞周期

Western blotting检测PI3K/Akt通路和细胞周期相关蛋白的表达变化。结果显示：相较于对照组，过表达CDHR2 可以抑制p-PI3K和p-Akt蛋白的表达，同时对周期蛋白Cyclin D1的表达也具有抑制作用（Plt;0.001，图10）。

2.7 CDHR2相互结合作用蛋白

STRING在线工具对CDHR2 可能存在的相互结合作用蛋白进行预测（图11），显示CDHR2 与CDC42、CDHR5 基因存在相关性（r=0.115，0.328）。

3 讨论

乳腺癌是全世界女性最常见的癌症类型［10］，发病率呈逐年上升，且呈年轻化发展趋势，其病死率在女性恶性肿瘤患者中仅次于肺癌。乳腺癌根据激素受体进行分子分型总共4种。第1种类型是luminal A类型，表示雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）为阳性，而HER-2受体表达为阴性。第2种是luminal B型，即ER和PR均为阳性，而HER-2 也呈阳性。第3 种是HER-2 过表达型，ER 阴性，PR 阴性和HER-2 阳性。第四种类型是ER，PR 和HER-2 均为阴性，也称为三阴型乳腺癌［11］。随着肿瘤手术、放化疗、分子治疗等进展［12， 13］，乳腺癌总体预后有了较好的改善，但其复杂的分子机制仍需进一步探讨。

钙粘蛋白相关家族成员2（CDHR2）也被命名为PCDH24属于原钙粘蛋白家族，PCDH 家族在钙依赖性细胞粘着中扮演重要角色［5， 14］。在许多人类癌症（包括乳腺癌，白血病，成胶质细胞瘤，胃癌，结直肠癌，食道癌和辐射诱发的肺癌）中已经报道了一些 PCDH 家族成员（ 例如 PCDH8，PCDH9，PCDH10，PCDH17 和PCDH20）的表达丧失，表明PCDH可以作为人类癌症的肿瘤抑制剂［15-17］。研究表明，CDHR2在上皮细胞侧壁的接触抑制过程中发挥着关键的作用，并可能导致接触抑制起到抑癌作用。CDHR2是一种与多种癌症相关的蛋白，其在多种癌症中发挥着重要的抑制或促进作用。例如CDHR2在肝癌和结肠癌中低表达，在肝癌中通过AKT失活以及COX-2表达下调来实现保护作用［18］，在HCT116结肠癌细胞中表达升高诱导接触抑制，从而完全消除体内肿瘤的形成［19］。一致的是，CDHR2可以抑制β-连环蛋白介导的细胞-细胞相互作用，导致细胞增殖抑制和肿瘤生长停滞在结直肠癌［20］。然而，CDHR2在乳腺癌癌中的作用及其机制还知之甚少。

本研究首先通过TCGA数据集对CDHR2 表达进行分析，由于CDHR2相对表达量较低，因此在乳腺癌及癌旁中CDHR2表达量差异无统计学意义，查阅已有文献报道，CDHR2 在乳腺癌中亦可能作为抑癌基因起效［15-17］。进一步使用Kaplan-Meier Plotter 在线数据分析CDHR2 在三阴型、luminal A型、luminal B型、Her2过表达型乳腺癌患者中的生存预后，我们发现在4种乳腺癌类型中趋势均为CDHR2高表达患者预后更好，但在Her2过表达型乳腺癌患者的生存曲线尚不具有统计学意义，可能与Her2 过表达型乳腺癌患者样本数量有关，亦或者CDHR2在三阴型乳腺癌或luminal型乳腺癌中发挥作用更加显著，但总的来说CDHR2高表达有利于乳腺癌患者的生存预后。但总的来说CDHR2 高表达有利于乳腺癌患者的生存预后。于是我们利用免疫组化、Western blotting 和qRT-PCR实验进一步证明了CDHR2在乳腺癌组织及细胞中表达下调，在表达较低的乳腺癌细胞MDA-MB-231 和MCF7 中成功过表达CDHR2，通过CCK-8 实验和EdU 实验表明过表达CDHR2能抑制乳腺癌细胞的增殖能力，进一步通过流式细胞术细胞周期实验发现过表达CDHR2 能够使细胞周期阻滞在G0/G1期，从而抑制乳腺癌细胞生长。这提示CDHR2在乳腺癌中是一个抑癌基因。

PI3K/Akt 是调控细胞生长、增殖、迁移、生存及凋亡的重要途径，该通路的异常激活可导致多种肿瘤细胞的存活和增殖［21-23］。CCND1，即G1/S特异性细胞周期蛋白，调节从G1 期向S期过渡的细胞周期过程［24］。越来越多的研究表明，许多基因通过调节 CCND1 影响肿瘤细胞的活力和迁移［25］。有研究表明CDCA2 通过激活 PI3K/AKT途径调节 CCND1 的表达促进结直肠癌细胞增殖［26］。另外，有研究发现多个基因在多种疾病中可以作用于PI3K/AKT信号通路进而影响细胞周期［27］。本研究通过Western blotting 发现过表达CDHR2 可以抑制p-PI3K和p-Akt 蛋白的表达，下调蛋白Cyclin D1的表达，据此，我们提出假说：CDHR2 可能通过调控PI3K/Akt信号途径，下调 CyclinD1的表达，进而影响乳腺癌细胞的增殖和周期。

蛋白质-蛋白质相互作用在细胞的 DNA复制，转录调节，信号转导变异，分子运输以及识别和修饰外来分子等方面发挥着重要作用［28-30］。我们通过String在线分析CDHR2 的候选相互作用蛋白。后续研究中我们可以着眼于蛋白间相互作用，进一步探究细胞内信号传导的分子基础CDHR2调控细胞周期的具体机制。

综合而言，本研究证实了CDHR2在乳腺癌细胞中的表达水平及重要作用，有望为乳腺癌的治疗提供新的靶点和理论依据。

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（编辑：吴锦雅）

基金项目：国家自然科学基金（81872251）；广东省自然科学基金（2020A1515010093，2021A1515012104）；南方医科大学中西医结合医院院长基金（1202102002）