3种中草药浸提液对梨黑斑病菌的拮抗筛选

摘 要：本文采用菌丝生长速率法，以三七、铁皮石斛、小球藻3种中草药为试材，研究中草药单剂和复合剂配方对梨黑斑病病原菌菌丝生长的拮抗效果，以期筛选出抑菌效果最佳的浸提液单剂和复合剂。结果表明：单剂中小球藻在浓度为100 mg/mL时抑菌效果最好，与其他处理有显著差异，其抑菌率为68%，且随着浓度的降低，抑菌效果越差；其次为三七、铁皮石斛。复合剂中铁皮石斛、三七、小球藻（体积比1∶2 ∶3）浓度为100 mg/mL时，对梨黑斑病菌的抑制作用最好，抑菌率为69%，且小球藻比例越高，抑菌效果就越明显，其次分别为三七、铁皮石斛。由此可知复合剂中起决定作用的中草药从高到低为：小球藻＞三七＞铁皮石斛；而3种中草药配比相同时抑菌效果最弱，可能是因其抑菌效果相互抵消造成的。由此可知小球藻是防治梨黑斑病病菌潜在的植物资源，具有很大的研发前景。

关键词：梨黑斑病；浸提液；中草药；拮抗

中图分类号：S436.612.1+4 文献标识码：A DOI编码：10.19440/j.cnki.1006-9402.2024.03.009

全世界约80多个国家有梨（Pyrus）规模化生产，梨品种约2 000个，而我国就有1 200多个。梨是我国第三大果树，其种植面积、产量及出口量均居世界前例[1-2]。梨产业在我国农业中占有重要地位并具有一定的生产规模，是很多地方的农业支柱产业。而梨黑斑病的发生，对梨产量和质量造成了严重的影响。

梨黑斑病是梨产业中最常见及最具破坏性的病害之一，由链格孢菌Alternaria alternate（Fr.）Keissl引起，该病长期以来普遍发生，已成为制约我国梨果生产的关键因素[3-6]。目前生产上主要依靠化学防治，虽然防治效力最高，时间最短，使用方法简便，但由于长期使用，存在抗药性、农药残留和环境污染等问题[7-8]。因此，寻找安全高效的防治方法对提高果品产量与质量具有重要意义。其中，生物防治手段具有安全、低毒、高效等特点，是当前病害防治研究的方向和热点。有研究发现酵母菌和枯草芽孢杆菌对梨黑斑病菌有一定的抑制效果[9-11]，高小宽研究三七、五味子和白果提取物对梨黑斑病菌均有不同程度的抑制作用[12]。但当前可利用的梨树黑斑病菌拮抗菌资源还很有限，仍需进一步挖掘和研究。

本文以3种中草药提取物为试材，以梨黑斑病菌为研究对象，分析3种中草药对梨黑斑病菌的抑菌活性，为进一步研制和开发新型天然杀菌剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 小球藻粉（Chlorella vulgaris）由东台市赐百年生物工程有限公司提供，三七粉（Panax pseudo-ginseng）和铁皮石斛粉（Dendrobium officinale Kimura et Migo）由安徽东方帝维生物制品股份有限公司提供。梨黑斑病菌（Botryosphaeria€燿othidea）由衡水学院微生物实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 浸提液的制备 将中草药粉碎过筛，取50 g于锥形瓶中，加入200 mL70%乙醇搅拌均匀，然后封口。放入摇床震荡1 min，静置 24 h后放入超声波清洗器（50 khz）提取10 min，立即搅拌抽滤，滤液在旋转蒸发仪上进行旋转蒸发（70 ℃，100 r/min），待溶液减少至约20 mL时停止旋转蒸发，用70%乙醇定容至50 mL作为母液，编号后，放入4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 各浸提液对梨黑斑病菌丝生长的抑制作用 采用菌丝生长速率法，配制不同浓度的中草药浸提液。取浸提液于100 mL已融化并冷却至50 ℃的PDA培养基中，充分摇匀，并迅速倒入直径为9 cm培养皿中，使提取物最终浓度为0.01、0.1、1 、10 、100 mg/mL。从恒温生化培养箱中取出活化的梨黑斑病菌，用6 mm打孔器在菌饼外围打取菌饼，挑取菌饼菌丝面朝下接种到浸提液单剂处理的PDA平板中央，以PDA培养基作为空白对照，重复3次。置于25 ℃恒温箱中培养。待5 d后，采用十字交叉法测定菌落直径并计算菌丝生长抑制率。

1.2.3 浸提液复合剂对梨黑斑病菌丝生长的抑制作用 将3种中草药浸提液按照不同体积配比配制成12 mL的浸提液复合剂（见表1），取浸提液于100 mL已融化并冷却至50 ℃的PDA培养基中。充分摇匀，并迅速倒入直径为9 cm的培养皿中，使提取物复合剂最终浓度为0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 mg/mL，操作方法同上。

1.3 数据处理 用Excel软件对数据进行处理，用SPSS22.0软件进行方差分析，差异显著性水平为5%（P<0.05）。

抑菌率/%=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径€？00%

2 结果与分析

2.1 各浸提液对梨黑斑病菌菌丝生长的抑制作用

由表2可知，随着中草药浸提液浓度的升高，梨黑斑病菌直径越小，抑菌效果越好，即100 mg/mL＞10 mg/mL＞1 mg/mL＞0.1 mg/mL＞0.01 mg/mL；其中小球藻单剂浓度为100 mg/mL时抑制效果最好，其抑菌率为68%，且与其它处理呈显著性差异；其次分别为三七、铁皮石斛，抑菌率分别为39%、29%，且与其他处理呈显著性差异，可知中草药单剂抑菌效果为小球藻＞三七＞铁皮石斛（见图1）。三七、小球藻、铁皮石斛单剂浓度为1 mg/mL、0.1 mg/mL、0.01 mg/mL时抑菌效果为负数，梨黑斑病菌落直径大于对照CK的直径，说明中草药单剂在低浓度时不仅没有抑菌效果，反而有促进梨黑斑病菌生长的效果，可见3种中药浸提液单剂对梨黑斑病菌生长的效果为低浓度促进，高浓度抑制，且浓度越高抑菌效果越好。

2.2 浸提液复合剂对梨黑斑病菌菌丝生长抑制作用

由表3可知，中草药复合剂浓度为100 mg/mL时抑菌效果最好，且与其他浓度的中草药复合剂有显著性差异，且随着复合剂浓度的升高，抑菌效果越好。在复合剂配方不同时，3种中草药相同配比时抑菌效果最弱，可能是因其抑菌效果相互抵消造成的；而在复合剂中，小球藻的浓度越高，抑菌效果就越明显（如表2），可知复合剂中起决定作用的中草药，从高到低为：小球藻＞三七＞铁皮石斛。试验中存在抑菌率为负数的情况，菌落直径大于对照CK的直径，说明中草药复合剂在低浓度时不仅没有抑菌效果，反而促进菌落生长。

3 结论

采用菌丝生长速率法测定3种中草药浸提液单剂和复合剂对梨黑斑病菌抑制效果。分析可知单剂中100 mg/mL的小球藻，对梨黑斑病有较好的抑菌效果，抑菌率为68%，且与其它处理差异显著；复合剂100 mg/mL时抑制效果最好，且与其它处理差异显著，其中复合剂HSX（1∶2∶3）100 mg/mL时抑菌效果最好，抑菌率为69%，对梨黑斑病菌有明显的拮抗作用。

不管是单剂还是复合剂，小球藻或小球藻配比多，其抑菌效果均比同水平其它处理好，可见小球藻是潜在防治梨黑斑病的资源，为进一步筛选防治梨黑斑病病菌的生物防治奠定了基础。本项目组拟尝试引进植物激素与浸提液互作，以期提高浸提液的抑菌率，这需要后续试验验证；且室内与室外试验环境不同，实际效果还要通过后期的田间试验来确定。

参考文献

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