实时荧光定量PCR技术在食品检测中的应用进展

“民以食为天，食以安为先”。近年来，食品安全事件时有发生，泰国假香米、阿斯巴甜致癌疑云、“鼠头鸭脖”等事件不断被曝光，公众对食品安全的关注度日益提高。为了保障食品安全，监管部门加强了对食品检测技术的研发和应用。在各种检测技术中，PCR技术尤其是实时荧光定量PCR，因具有更灵敏、更省时、更特异等优点，在食品安全检测领域得到了广泛应用。本文综述了实时荧光定量PCR技术的原理，及其在食品中植物源性成分、转基因成分、过敏原、动物源成分和微生物等检测中的应用进展，并对该技术未来的发展方向进行了展望，以期该技术未来在食品检测领域得到更广泛的应用。

一、聚合酶链式反应原理

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是1983年美国科学家Kary B.Mullis发明的一种在体外快速扩增特定DNA的分子生物学技术，其基本原理类似于DNA的天然半保留复制，反应过程包括“变性、退火、延伸”三个阶段。

聚合酶链式反应的具体过程如图1所示，双链DNA在高温条件下变性解旋为单链DNA，然后引物与模板DNA互补区结合，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，按照碱基互补配对原则，引物沿着5’→3’的方向合成新的DNA链，实现目标DNA的扩增。理论上讲，如果PCR反应体系中酶与底物充足，即可实现目标DNA的指数级扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳等方法观察扩增产物条带大小，进而达到检测目的。

图1：PCR扩增过程示意图

（①：变性；②：退火；③：延伸）

经过40余年的发展，PCR检测技术已经非常成熟，在生物、食品、药品、医学等领域得到广泛应用。通过不断改良或与其他技术相结合，已衍生出多种PCR技术，实时荧光定量PCR即是其中的一种。

二、实时荧光定量PCR概述

实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）被称为第二代PCR，是在常规PCR基础上发展而来的一种核酸定量检测技术，其原理是将荧光标记物加入PCR反应体系中，随着PCR反应产物的增加，荧光信号不断增强，利用检测设备收集荧光信号，实现对PCR过程的实时监测，最后通过荧光扩增曲线分析扩增结果。根据加入的荧光标记物的不同，该技术分为荧光染料法和荧光探针法两种。

（一）荧光染料法

qPCR常用的荧光染料是SYBR Green I。在qPCR反应体系中加入过量的荧光染料，一般情况下，荧光染料在游离状态下几乎不发出荧光信号，反应开始后，荧光染料可与双链DNA小沟区域非特异性结合，产生荧光信号。随着PCR反应的进行，荧光信号不断增强，此时可利用检测设备收集荧光信号，实时监测PCR反应过程（图2）。

图2：荧光染料法qPCR原理示意图

（二）荧光探针法

qPCR常用的荧光探针为TaqMan，探针的5’端和3’端分别标记一个报告基团和一个淬灭基团。完整的探针中，报告基团的荧光信号会被淬灭基团淬灭，不产生荧光，探针水解后，报告基团逃离淬灭基团的淬灭范围，发出荧光信号。PCR扩增时，引物和探针同时与模板DNA结合，当延伸到探针与模板结合位置时，Taq DNA聚合酶利用5’-3’外切酶活性将探针水解切割，报告基团和淬灭基团分离，释放荧光信号（图3）。PCR过程中，每形成一条DNA双链，就会释放一种荧光信号，信号强度也相应增加，随着PCR产物的积累，检测到的荧光信号强度也不断增加。

图3：荧光探针法qPCR原理示意图

三、qPCR技术在食品检测中的应用

qPCR与常规PCR相比，扩增片段相对较短，利用荧光信号可以实时监测PCR反应过程，且不需要PCR后再处理，有效预防PCR产物潜在的污染，具有特异性好、灵敏度高、快速、交叉污染风险低等优点，在食品安全检测等领域应用广泛。

（一）植物源性成分检测

2023年6月，国家市场监管总局发布补充检验方法《果汁中植物源性成分的测定》（BJS 202304），对果汁、果浆以及果肉饮料等样品中黑加仑、蓝莓、树莓、木瓜、桑葚、椰子、猕猴桃、杏、山楂、蔓越莓、芒果、梨、桃、苹果等植物源性成分采用qPCR方法进行定性检测。Elisa等以醇溶蛋白基因为靶基因，设计了双重qPCR引物探针，很好地区分出普通小麦和硬质小麦，首次利用分子生物学方法实现了面粉中掺杂掺伪的分析。

（二）转基因食品检测

转基因技术的发展为解决全球粮食问题起到了关键作用，然而转基因食品的安全性一直备受争议，关于建立转基因标识制度，世界各国仍未达成共识。我国食品安全法第六十九条规定，生产经营转基因食品应当按照规定显著标示。农业农村部、国家市场监管总局及国家标准化管理委员会等均发布了转基因成分检测的相关标准，主要针对的是转基因植物及其产品，如转基因玉米、水稻、大豆、番茄、油菜及其相应的产品等，其中绝大多数采用的检测方法是实时荧光定量PCR荧光探针法。温洪涛等对转基因抗虫耐除草剂MZIＲ098基因的5’端旁侧序列信息进行分析并设计引物探针，建立了特异性针对玉米中MZIＲ098转化体的qPCR定量检测方法，检出限达0.05%。

（三）过敏原检测

海鲜类、豆类、乳制品、果蔬类等多种食品中存在的过敏成分，会导致部分易敏体质人群产生过敏反应。原卫生部发布的食品安全国家标准《预包装食品标签通则》（GB 7718-2011）要求，在食品配料中对致敏物质进行推荐性标识。SN/T 1961系列方法提出了利用qPCR法测定食品中花生、大豆、胡桃、杏仁、麸质、虾蟹等过敏原的检测方法。Madrid等利用qPCR法成功检测出100个样品中的致敏成分。

（四）动物源性成分检测

畜肉产品掺杂掺假的现象时有发生，媒体曾曝光称，市场上流通的所谓“驴肉”很大一部分是猪肉和马肉伪装而成，因此，实现动物源性成分的快速、准确鉴定尤为重要。2019年，国家标准化管理委员会和国家市场监督管理总局发布国家标准《常见畜禽动物源性成分检测方法 实时荧光PCR法》（GB/T 38164-2019），可利用实时荧光PCR法，对肉及加工品、内脏、乳、动物饲料中黄牛、牦牛、水牛、绵羊、山羊、猪等多种动物源性成分进行定性检测。Li等在检测羊肉掺假时，通过分析16S rRNA和12S rRNA序列，设计3对特异性引物，成功鉴别出绵羊、狗、鸡鸭等成分。

（五）微生物检测

因qPCR技术的优点，其在食品微生物检测中的应用越来越广泛，食品安全国家标准GB 4789系列中，已经实施的《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》（GB 4789.35-2023）和刚刚实施的《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌检验》（GB 4789.40-2024）均增加了PCR方法。大量研究也发现，qPCR应用于食品微生物的检测，确实提高了检测效率。Kumar等建立了海鲜中沙门氏菌的qPCR检测方法，缩短了检测时间，提高了检测效率。李丹丹等针对金黄色葡萄球菌Sa442基因设计引物和探针，建立了金黄色葡萄球菌的qPCR检测方法，检测灵敏度达7.5CFU/mL。

此外，qPCR技术也是检测非洲猪瘟病毒、诺如病毒的重要手段。贾云飞等利用非洲猪瘟病毒P72基因，建立了非洲猪瘟病毒SYBR Green I qPCR检测方法。《食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验》（GB 4789.42-2016）中建立了食品中诺如病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，实现了贝类、生食蔬菜、胡萝卜、瓜、坚果等硬质表面食品，草莓、西红柿、葡萄等软质水果等食品中诺如病毒核酸的检测。

综上，食品安全是关乎人民群众身体健康的重大问题，而食品检测是保障食品安全的重要防线。qPCR技术的发展为实现食品的快速、高效、高灵敏度检测提供了可能，但也存在一定的局限，如引物设计复杂、难以实现定量分析、易受污染、容易产生假阳性等，因此，进一步优化引物设计、提高引物的特异性、避免不同引物间的相互干扰、避免假阳性的出现是未来研发的方向。另外，将该技术与免疫技术、电化学技术、光学技术、生物传感技术等结合，进而开发出更高灵敏度、更强特异性、更高准确性、更高通量、更广适用范围、更快速度的检测技术，也是未来食品检测的发展趋势。