印迹-解析电喷雾/光电离质谱成像技术研究烤烟叶中化学成分的空间分布

摘要 利用印迹-解析电喷雾/光电离质谱成像（IM-DESI/PI-MSI）技术对初烤后干烟叶不同部位化学成分的空间分布进行了研究，获得了烟叶中不同化学成分的纵/横向相对含量分布规律。采用印迹方法可将烟叶内部化合物转移至多孔聚四氟乙烯板的表面，实现对烟叶内部物质的检测和可视化分析，并且经解析电喷雾后，光电离质谱成像技术具有对植物样本的无极性歧视、软电离和高电离效率等优点，可同时检测和成像烟叶样本中丰富的化合物。基于高分辨质谱共鉴定出40 种化学成分，包括植物碱、氨基酸、糖类、酸、酮和酚等。实验结果表明，烟草的代表性化学成分如植物碱、氨基酸和糖类等，从纵向分析主要分布在近叶尖处，从横向分析主要分布在烟叶左右边缘；并检测出Amadori 化合物（1-脱氧-1-L-脯氨酸-D-果糖），发现其含量变化与游离氨基酸（脯氨酸）的含量变化趋势总体一致。此外，对烟草的气候斑点病区域进行了成像研究，发现化合物在气候斑区域呈特异性分布。本方法在烟叶生长应激研究方面具有优势。

关键词 烟叶；质谱成像；光电离；印迹；化学成分

烟草化学成分是烟草品质形成的物质基础[1-3]。研究表明，烟草化学成分不仅与烟草的类型、产地气候[4]、等级、成熟度[5]和部位（整颗植株上部、中部和下部）密切相关，而且在单片烟叶的不同区域内化学成分的分布也存在较大差异。因此，在获得整片烟叶化学成分信息的基础上，进一步研究单片烟叶中化学成分的空间分布，对于理解烟草农业生产中烟草化学成分的迁移和合成，以及烟草工业中的复烤和叶组配方的精准设计都具有重要意义。

近年来，已有研究者对单片烟叶中化学成分的空间分布情况进行了研究。Thyssen 等[6]采用激光烧蚀电感耦合等离子体发射光谱方法研究了烟草茎和叶柄中Ca、Na 和K 的分布，并将分析结果与激光烧蚀电感耦合等离子体质谱法获得的成像结果进行了比较；Wang 等[7]测量了烤烟单片烟叶中4 种常规化学成分（烟碱、糖、K+和Cl‒）和28 种中性致香物质在单片烟叶中的空间分布；Murakami 等[8]利用捆绑的针对烟草叶片进行微穿孔，并采用印迹法检测烟草叶片中内源性蛋白质和病毒外壳的蛋白质基因表达的空间分布。

质谱成像（MSI）技术作为一种映射分子空间分布的新手段，近年来备受关注。其中，解析电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI）可在大气压环境下实施，已成为质谱成像最常用的方法[9]。本研究组在前期工作中，基于DESI-MSI 技术构建了一种印迹-解析电喷雾/二次光电离质谱成像（IM-DESI/PI-MSI）方法，应用于新鲜植物叶片分子成像[10]。该方法通过对植物叶片施加压力，将分析物从植物表面转移到多孔聚四氟乙烯薄膜，保留了植物样品的空间完整性。将真空紫外光电离与DESI 结合，可解决DESI 的电离极性歧视和复杂生物条件下的离子抑制问题[11]。

本研究利用IM-DESI/PI-MSI 技术对初烤后的干烟叶进行横向和纵向的局部成像分析，获得了烤烟中部分化合物的空间分布规律，进一步考察了IM-DESI/PI-MSI 对烟叶气候斑点病区域的成像效果，为分析烟草化学成分在单片烟叶中的分布提供了一种直观且准确的方法，有助于改进烟草生产加工工艺，提高烟草产品的质量和安全性。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂和材料

Agilent 6224 精确质量飞行时间质谱（美国Agilent 公司）；HWS-80B 恒温恒湿培养箱（上海坤天实验室仪器有限公司）；MGC101H 2D 精密电控移动平台（北京北光世纪仪器有限公司）；PKS 106 直流激发光离子化灯（英国Heraeus 公司）。

甲醇和甲苯（HPLC 级，德国Merk 公司）；三氟乙酸（优级纯，美国Sigma-Aldrich 公司）；雾化气体氮气（超高纯，南京特种气体厂有限公司）；

多孔聚四氟乙烯（PTFE）板（厚度1.6 mm，孔隙率36%，孔径7 μm，德国Berghof 集团）。初烤烟叶片样品（长度（60±3） cm；产地：云南文山，“云烟87”品种、B2F 等级，大田规范化栽培）。

1.2 实验方法

1.2.1 印迹方法

烟叶叶片的光学图像由数码显微镜拍摄。图1 是印迹多孔PTFE 板制作和DESI/PI-MSI 实验流程图。以烟叶样本纵向的印迹过程为例，首先，将烟叶置于22 ℃和相对湿度为70%的恒温恒箱中平衡6 h后，烟叶较湿润且有韧性；将烟叶铺展开，沿叶尖到叶基的纵向近等距离选取8 个区域，使用内径为3 mm 的圆形打孔器在各区域内横向截取3 个切片，共获得24 个直径为3 mm 的切片；将24 个切片置于上述恒温恒湿箱中平衡12 h， 使所有烟叶圆片的湿度保持一致。平衡结束后，将样品摆放在一块多孔PTFE 板上，并在样品上方覆盖几层薄纸，减少烟叶内物质离域；将两块铝板分别放置在薄纸上方和PTFE 板下方，通过压片机在铝板上逐渐施加约4 MPa 的压力，获得烟叶在多孔PTFE 板表面的印迹。

1.2.2 质谱成像方法

成像系统由DESI/PI 组件、2D 精密电控移动平台和Agilent 6224 飞行时间质谱组成，其中， DESI/PI组件包括DESI 喷雾器和二次光电离装置。DESI 喷雾器由2 个同轴石英毛细管组成（内部毛细管：i.d. 50 μm， o.d. 150 μm；外部毛细管：i.d. 250 μm， o.d. 350 μm）， 喷雾溶剂为甲醇-甲苯-三氟乙酸（70∶30∶0.1， V/V），喷雾电压3500 V。实验过程中，打开光电离源（氪直流放电灯），在1.3 MPa 雾化气N2的辅助下，将雾化溶剂以53°入射角喷射（3 μL/min）到组织切片表面进行样本解析。

印迹后的PTFE 板通过双面胶粘于载玻片上，当DESI 喷雾针对PTFE 板上的印迹区域进行解析时，加热传输管道（i.d. 0.5 mm， o.d. 0.16 mm， 250 ℃）， 以15°的倾斜角将解析的化合物吸入二次光电离装置内，未电离的中性分子在管状光电离室中由真空紫外光进一步离子化，再进行质谱检测。成像时， X 方向电控移动平台扫描速率为0.37 mm/s，质谱的采样频率为2 spec/s， Y 方向行间距为0.2 mm。成像空间分辨率约为200 μm， 所有操作均由LabVIEW 自编程控制软件控制。

1.2.3 数据处理方法

利用开源软件MSConvert 和imzMLConverter 将多条扫描线获取的数据文件合并为imzML 文件，然后由MSireader 软件打开并读取，以实现各种离子的可视化分析。不同物质在特定区域的平均信号强度可通过成像软件中手动定义感兴趣的区域（ROI）功能进行定义，并导出用于分析。本研究利用ROI 功能对不同样品圆区域分别进行化合物的平均信号强度提取，并计算出每个位置点裁剪的3 个样品圆的平均信号强度，用于分析化合物在烟叶不同区域的含量分布规律。

2 结果与讨论

2.1 质谱图及质谱峰的定性分析结果

在正离子模式下，利用IM-DESI/PI-MSI 方法获得初烤干烟叶的质谱图见图2，通过精确质荷比（m/z）、同位素丰度、相关文献和“中国烟草科学技术数据库”（https：//sjk.ztri.com.cn/tobacco/index.jsp）等对检测到的主要质谱峰进行定性分析，共鉴别出40 种化合物，包括生物碱、氨基酸、糖类、醇、酮、酯、醛、酚、酸和胺等，基本涵盖了大部分常见的烟草化学成分类别（见电子版文后支持信息表S1）。

2.2 烟叶化学成分强度纵向分布情况

图3A 为烟叶叶片纵向取样位置点示意图，图3B 为印记后12 种代表性化学物质的质谱成像图，可以通过颜色差异直接观察每种物质从叶尖到叶基处的含量变化。相较于色谱-质谱分析方法获取上述化学物质在不同部位的相对含量，质谱成像可直观展示化学成分在样品表面的强度分布信息，从而实现样本不同部位化学组分的半定量分析。

图3C 是取样点1～8 处5 种植物碱（烟碱烯、去氢新烟碱、烟碱、N′-甲酰基降烟碱和（R，S）-N-乙基降烟碱/N′-甲基假木贼碱）在烟叶叶面的纵向强度分布图（信号强度为每个取样点3 个切片成像后的平均信号强度，下同）。植物碱含量是决定烟叶内在品质的要素，对烟叶的生理强度、吃味、刺激性和烟叶香气都有重要影响[12]。烟草植物碱的主要成分包括烟碱和去氢新烟碱等，其含量过高或过低都会导致烟叶化学成分含量不协调，降低可用性。二烯烟碱是烟碱的代谢产物，是一种重要的次要烟草生物碱。烟草中只存在微量的N′-甲酰基降烟碱和（R，S）-N-乙基降烟碱/N′-甲基假木贼碱，两者是烟草和卷烟烟气最重要的化学成分之一，影响卷烟的香气量、浓度和刺激性，同时还是烟草特有亚硝胺（TSNAs）的前体物质。烟碱在烟叶不同位置的含量不同，如图3C 中蓝色折线所示，烟碱在烟叶的近叶尖处含量最高，从叶尖到叶中处含量逐渐降低，在叶中和近叶基处烟碱含量变化较平缓。除烟碱外，其它植物碱含量相对较低，由叶尖至叶基方向变化整体趋势与烟碱一致。

图3D 是5 种氨基酸（L-脯氨酸、3-（N-亚硝基-N-甲氨基）丙酸/天门冬酰胺、5-氨基-羟基戊酸、谷氨酸和α-氨基己二酸）在烟叶叶面的纵向强度分布图。氨基酸作为烟草中一类重要的含氮化合物，其组成和含量与烟叶的品质密切相关，每种氨基酸对香味的贡献值不同，常作为检测烟叶品质的重要指标[13]。有研究表明，烟叶经烘烤后，其游离氨基酸的总量显著增加，主要来自于脯氨酸的贡献[14]，这与本研究观察到的脯氨酸的含量远高于其它游离氨基酸的现象一致。此外，本研究还发现脯氨酸在近叶尖处含量最高，从叶中到近叶基处含量持续下降。5-氨基-羟基戊酸和谷氨酸从叶尖到叶基处的含量变化趋势与脯氨酸相似。α-氨基己二酸在近叶尖处含量最高，从近叶尖到叶中处含量降低，从叶中到叶基处含量基本无变化。3-（N-亚硝基-N-甲氨基）丙酸/天门冬酰胺是另一种氨基酸成分，在烟叶中的整体含量较低，从叶尖到叶基处含量分布较均匀。

美拉德反应是烟叶烘烤过程中香味物质形成的主要途径之一。Amadori 化合物是美拉德反应中醛糖和不同氨基酸通过缩合、脱水、重排而得到的一类稳定产物，在香气、风味和颜色的形成过程中发挥了核心作用[15-17]。研究烘烤后烟叶中Amadori 化合物的含量变化趋势对提高烟叶的感官品质具有重要意义。如图3E 所示，作为脯氨酸与葡萄糖发生美拉德反应的Amadori 化合物， 1-脱氧-1-L-脯氨酸-D-果糖在烘烤后烟叶纵切的含量变化趋势与脯氨酸的含量变化趋势总体一致，即近叶尖处最高，近叶尖处到近叶基处含量持续下降，与文献[18]的结果一致。Amadori 化合物是在烘烤过程中产生的，因烘烤过程中淀粉降解生成的葡萄糖含量充足，底物氨基酸含量差异是影响Amadori 化合物含量差异的主要因素，因此， Amadori 化合物含量变化与烤后烟叶中游离氨基酸含量变化的总体趋势一致。

糖类物质是烟草中一类重要物质，是构成植物骨架和网络的结构物质，也是影响烟气醇和性的重要因素。糖类物质含量在适宜范围内可降低烟气吃味强度，减轻刺激性和苦味，改善余味，对卷烟产品的香气与品质有重要影响[19]， 1-[1′-（2′S）-降烟碱]-1-脱氧-β-D-呋喃果糖是烟草中重要的糖类物质，分析此物质在烘烤后烟叶中的含量变化对开发卷烟新配方以及卷烟加工具有指导意义。如图3E 所示， 1-[1′-（2′S）-降烟碱]-1-脱氧-β-D-呋喃果糖在近叶尖处含量最高，从近叶尖到近叶基处含量缓慢降低后趋于平缓。

通过分析不同化合物从叶尖端到叶基端的分布趋势可发现，植物碱类、氨基酸类和糖类等化学物质在烤烟尖端的含量相对较高。

2.3 烟叶化学成分强度横向分布情况

为探究烟叶成分横向分布规律，沿烟叶横向最宽叶腰部从左侧外缘到右侧外缘绕开主脉近等距离选取8 个区域（图4A）。图4B 展示了印记后12 种代表性化学物质的质谱成像图。

图4C 是横向取样位置点1～8 处5 种植物碱在烟叶叶面的强度分布图。其中，烟碱从叶梗到左边缘的含量逐渐增加，从叶梗到右边缘的含量先减少后增加，并且在左右边缘处含量最高。烟碱烯、去氢新烟碱、N′-甲酰基降烟碱和（R，S）-N-乙基降烟碱/N′-甲基假木贼碱等植物碱物质虽整体含量较低，但从叶梗到叶边缘的含量变化趋势与烟碱基本一致。

图4D 是横向取样位置点1～8 处5 种氨基酸在烟叶叶面的强度分布图。其中，脯氨酸从叶梗到左边缘的含量逐渐增加，从叶梗到右边缘的含量先减少后增加，并且在左右边缘处含量最高。5-氨基-羟基戊酸从叶尖到叶基处的变化趋势与脯氨酸相似。3-（N-亚硝基-N-甲氨基）丙酸/天门冬酰胺、谷氨酸和α-氨基己二酸3 种物质从左边缘到叶梗的含量都逐渐降低，但从叶梗到右边缘的含量表现出差异：3-（N-亚硝基-N-甲氨基）丙酸/天门冬酰胺含量先减少后增加；谷氨酸含量缓慢下降；α-氨基己二酸含量分布均匀。总之， 3 种物质的含量在烟叶左右边缘处最高。

如图4E 所示， Amadori 化合物1-脱氧-1-L-脯氨酸-D-果糖在烘烤后烟叶中的含量横向分布变化趋势与脯氨酸的含量变化趋势总体一致，从叶梗到左边缘的含量逐渐增加，从叶梗到右边缘的含量先减少后增加，在左右边缘处的含量最高。1-[1′-（2′S）-降烟碱]-1-脱氧-β-D-呋喃果糖在烟叶横向的分布规律为从叶梗到左边缘的含量逐渐增加，从叶梗到右边缘的含量先减少后增加，在左右边缘处的含量最高。

图4C、4D 和4E 中化合物含量变化趋势不是完全以叶梗左右对称的，有很多影响因素，包括烟草的栽培环境、自身生长发育和形态特征，以及烟叶的烘烤条件（温度、时间、湿度和烤架位置）等，这些因素可导致烤烟中物质的分布出现某些偏离。此外，在实验操作中裁剪的样品区域应尽量避开烟叶的脉络，导致位置点1～4 与位置点8～5 的选取并不是严格关于叶梗左右对称的，这也会影响折线图中化合物的含量关于叶梗的对称性。分析典型化合物在烟叶横向的含量趋势变化发现，植物碱类、氨基酸类和糖类等化学物质在烤烟叶的左右边缘处的含量相对较高。

2.4 烟叶气候斑的IM-DESI/PI-MSI结果

烟草气候斑点病（Tobacco weather fleck）是一种由空中臭氧引起的非侵染性病害，易发生在烟叶生长发育的旺盛阶段，通常表现为烟叶上出现不规则的黑斑、黄斑或棕斑，严重影响烟叶的质量和产量[20-22]。本研究采用IM-DESI/PI-MSI 对烟草气候斑点病区域化学成分分布进行了研究。

图5A 是烟叶气候斑位置示意图，图5B 是图5A 中烟叶气候斑点区域的放大光学图像，图5C～图5U是正离子模式下在气候斑附近检测到的代表性化合物的成像图。由成像图可见，大多数化合物在气候斑区域分布很少，甚至无分布，这是因为在烤后烟叶中，气候斑点处的总氮、烟碱、钾离子、总糖和游离氨基酸含量均下降[ 22]。植物碱类物质如烟碱烯（m/z 159.09）、去氢新烟碱（m/z 161.11）、烟碱（m/z 163.12）、N′-甲酰基降烟碱（m/z 177.10）、（R，S）-N-乙基降烟碱/N′-甲基假木贼碱（m/z 177.14），以及氨基酸类物质如L-脯氨酸（m/z 116.07）、5-氨基-羟基戊酸（m/z 134.08）、谷氨酸（m/z 148.06）和α-氨基己二酸（m/z 162.08）等的分布十分相似，即气候斑区域物质含量少，周围以及正常烟叶局部区域分布较多。Amadori 化合物如1-脱氧-1-L-脯氨酸-D-果糖（m/z 260.11）和1-[1′-（2′S）-降烟碱]-1-脱氧-β-D-呋喃果糖（m/z 293.15）除在中间气候斑区域基本无信号外，在其余烟叶区域信号分布比较均匀。此外，还发现了其它化合物的特异性分布，如物质m/z 193.05 主要分布在气候斑一圈， m/z 203.15、217.16 和291.22 等物质在气候斑外一圈和周围区域呈点状分布，这可能与植物应激引起的代谢异常有关。研究这些化合物在气候斑区域的特异性分布，可为进一步探究病害机理、深入了解发病规律以及制定防治措施等提供科学依据。

3 结论

采用IM-DESI/PI-MSI 在敞开环境下对初烤干烟叶进行局部成像，同时获得多种化合物在烟叶不同位置的浓度梯度，研究了烤烟叶片中一些代表性化学成分的空间分布规律。采用印迹方法可将烟叶内部化合物转移至印迹板的表面，可实现对烟叶内部物质的检测和分析，并且DESI/PI-MSI 技术具有对植物样本无极性歧视、软电离和高电离效率等优点，可同时检测和成像烟叶样本中丰富的化合物，包括植物碱、氨基酸、糖类、酸、酮和酚等。考察了烟草植物中代表性化合物在叶片纵向和横向的化学成分空间分布，对于烟叶中的植物碱、氨基酸和糖类等物质，纵向分析表明其主要分布在叶尖端，横向分析表明其主要分布在烟叶的左右边缘。最后，对烟叶气候斑点病区域进行了成像研究，发现化合物在气候斑区域呈特异性分布。研究结果表明， IM-DESI/PI-MSI 技术可为分析烟草化学成分在单片烟叶中的分布提供一种直观且准确的方法，为烟草种植和加工提供更加科学的指导，有助于优化烟草的生产流程和质量控制。

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