基于氧化聚合规律和特征质谱信息鉴定云南红茶中的新型茶黄素

摘要 茶黄素类化合物（TFs）是红茶中决定感官品质的一类重要物质，具有显著的生物活性。茶叶中除了存在4 种常见的TFs 外，还存在许多其它具有类似化学结构的茶黄素类似物（TFAs）。针对TFs 及TFAs，本研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱（UPLC-HRMS）技术，结合该类成分的特征结构及一、二级质谱信息，提出了基于氧化聚合规律和特征质谱信息的TFAs 识别和鉴定方法。通过分析现有TFs 的氧化聚合过程，总结形成TFs 的理论反应模型，并基于此计算潜在成分的前体离子值；同时，根据标准品和文献数据分析TFs的质谱裂解规律，总结该类成分的特征碎片离子及中性丢失碎片。最终，基于计算获得的前体离子值以及特征碎片离子或中性丢失信息，从原始的色谱-质谱数据中共鉴定出36 种TFAs，其中6 种为首次报道，并采用体外合成实验进行了部分验证。基于36 种成分的定性和定量分析结果，采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）研究了这些成分在红茶加工中的变化，结果表明， TFAs 可用于有效区分红茶发酵前后的样品。

关键词 茶黄素；氧化缩合；质谱；中性丢失；特征碎片离子

茶黄素类化合物（Theaflavins， TFs）是红茶中一类具有苯并卓酚酮结构的化合物总称[1]。TFs 与茶叶和茶汤的颜色等感官品质密切相关[2-3]， TFs 含量越高，茶汤汤色的感官品质评价越高[4]。此外， TFs具有抗氧化和抗癌[5-8]等多种生物活性，这主要源于其中的苯并卓酚酮子结构和该结构上的多羟基官能团[9]。此结构是在红茶加工过程中反应前体在内源酶的催化下发生氧化和缩合反应产生的[10-14]，其中，TFs 的反应前体均具备邻苯二酚和邻苯三酚的子结构[10-14]，例如，茶黄素（Theaflavin， TF）、茶黄素-3，3′-双没食子酸酯（Theaflavin-3，3′-di-O-gallate， TF-3，3′-G）、茶黄素-3′-没食子酸酯（Theaflavin-3′-di-O-gallate，TF-3′-G）和茶黄素-3-没食子酸酯（Theaflavin-3-di-O-gallate， TF-3-G）这4 种典型TFs 的前体物质均为儿茶素类化合物[15-16]。除儿茶素类成分外，茶叶中还富含许多同样具有邻苯二酚或邻苯三酚子结构的化合物，例如绿原酸（Chlorogenic acid， CGA）、没食子酸（Gallic acid， GA）、咖啡酸（Caffeic acid， CA）[17]和茶没食子素（Theogallin， TG）[18]等，这些物质同样符合氧化聚合产生TFs 的基本化学结构。然而，这些化合物是否能够产生苯并卓酚酮结构以及红茶中是否存在以这些化合物为前体合成的物质尚有待进一步研究。

近年的研究表明，茶叶中还存在由儿茶素类与非儿茶素类氧化聚合产生的且同样具备苯并卓酚酮结构和显著生物活性的茶黄素类似物（Theaflavin analogues， TFAs）。Zhang 等[19]发现CGA 与表儿茶素没食子酸酯（ECG）以及表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）生成的TFs 对人体结肠癌细胞具有显著的抑制作用。Itoh 等[20]研究表明，由EGCG 与GA 氧化聚合产生的TFs 具有显著的抗肥胖及抗牙周病等活性。然而，相比于4 种典型的TFs，针对这些具有潜在生物活性的TFAs 的研究较少。因此，建立一种TFAs 的高效识别和鉴定方法具有重要的意义。

超高效液相色谱-高分辨质谱（UPLC-HRMS）作为一种强大的分析工具，已被广泛应用于茶叶中化合物的定性与定量分析[21-22]。与紫外-可见吸收光谱法和核磁共振等技术相比， UPLC-HRMS 分析茶叶等复杂体系中的化合物时具有高灵敏度、高通量、可获得丰富的结构信息和定性结果较准确等优势[23-24]。但是，利用UPLC-HRMS 针对茶叶中的TFAs 进行深度鉴定时也存在数据复杂、标准品缺失和数据库不完善等问题。因此，在复杂数据的挖掘鉴定过程中不仅需要利用先验信息作为线索[25]，还需要特征质谱信息作为鉴定佐证[26]。

如前所述， TFs 的共性特征是前体成分均具有邻苯二酚或邻苯三酚的关键子结构，并且都通过氧化聚合反应而形成。因此，本研究针对茶叶中富含的邻苯二酚或邻苯三酚型化合物及其之间的氧化聚合反应，结合特征质谱信息，建立了一种高效识别和鉴定包括TFAs 在内的TFs 的UPLC-HRMS 方法。一方面，根据现有TFs 的氧化聚合原理总结氧化聚合反应的规律及相应的反应模型，并根据该模型总结茶叶中潜在的反应前体，进而计算出潜在的TFs 的理论分子量，根据理论分子量和UPLC-HRMS 实验信息（例如提取离子流图（EICs））进行靶向提取，判断茶叶中是否存在潜在的TFAs；另一方面，将总结TFs 的特征碎片离子和中性丢失等质谱特征裂解规律用于未知TFAs 的筛选和结构鉴定，基于鉴定结果，通过体外合成实验获取从红茶中鉴定的部分TFs，采用UPLC-HRMS 检测技术对其进行比对验证，并采用多元统计分析方法针对红茶加工阶段中的TFs 化合物进行定量及代谢分析，以期深入了解TFAs 在红茶中的存在及分布情况。