响应面法优化山楂多糖和山药多糖的提取工艺及其抗氧化活性研究

杨欣宇 高赛 刘寅初 高晓炜 冯随 高晓光

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.07.006

引文格式：杨欣宇，高赛，刘寅初，等.响应面法优化山楂多糖和山药多糖的提取工艺及其抗氧化活性研究.中国调味品，2024，49（7）：38-44，59.

YANG X Y， GAO S， LIU Y C， et al.Optimization of extraction process of polysaccharides from hawthorn and yam by response surface methodology and study on their antioxidant activities.China Condiment，2024，49（7）：38-44，59.

摘要：该研究优化超声波辅助热水提取山楂多糖和山药多糖的工艺，并研究其单糖组成和抗氧化活性。在单因素试验的基础上，以超声时间、料液比和浸提温度为因素，以多糖提取率为响应值，采用响应面法建立模型并分析。研究发现山楂多糖提取工艺的最佳参数为超声时间28 min、料液比1∶24.8（g/mL）、浸提温度71.5 ℃、浸提时间120 min，在此条件下，提取率为49.09%；山药多糖提取工艺的最佳参数为超声时间42 min、料液比1∶30（g/mL）、浸提温度70.0 ℃、浸提时间180 min，在此条件下，提取率为12.81%。通过离子色谱法确定了山楂多糖和山药多糖的单糖组成和比例。由体外抗氧化试验可知，山楂多糖对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基的清除率分别为80.58%、97.61%、68.4%，表现出较强的自由基清除能力。

关键词：山楂多糖；山药多糖；单糖；超声波；自由基；抗氧化活性

中图分类号：TS201.1      文献标志码：A      文章编号：1000-9973（2024）07-0038-07

Optimization of Extraction Process of Polysaccharides from Hawthorn and Yam by

Response Surface Methodology and Study on Their Antioxidant Activities

YANG Xin-yu1， GAO Sai1， LIU Yin-chu1， GAO Xiao-wei4， FENG Sui2，3， GAO Xiao-guang1*

（1.College of Food and Biology， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang 050018，

China; 2.Hebei Double Pigeon Foodstuffs Co.， Ltd.， Shijiazhuang 050021， China; 3.Shijiazhuang

Pig Industry Technology Research Institute， Shijiazhuang 050021， China; 4.Langfang

Shengwei Foodstuffs Co.， Ltd.， Langfang 065600， China）

Abstract： In this study， the process of ultrasound-assisted hot water extraction of hawthorn polysaccharides and yam polysaccharides is optimized， and their monosaccharide composition and antioxidant activity are investigated. On the basis of single factor test， with ultrasonic time， solid-liquid ratio and extraction temperature as the factors and polysaccharide extraction yield as the response value， the model is established and analyzed by response surface method. It is found that the optimal parameters of extraction process of polysaccharides from hawthorn are  ultrasonic time of 28 min， solid-liquid ratio of 1∶24.8（g/mL）， extraction temperature of 71.5 ℃ and extraction time of 120 min， under these conditions， the extraction yield is 49.09%. The optimal parameters of extraction process of polysaccharides from yam are ultrasonic time of 42 min， solid-liquid ratio of 1∶30 （g/mL）， extraction temperature of 70.0 ℃ and extraction time of 180 min， under these conditions， the extraction yield is 12.81%. The monosaccharide composition and proportion of polysaccharides from hawthorn and yam are determined by ion chromatography. In vitro antioxidant test shows that the scavenging rates of hawthorn polysaccharides on DPPH free radicals， ABTS free radicals and hydroxyl free radicals are 80.58%， 97.61%， 68.4% respectively， showing stronger free radical scavenging capacity.

Key words： hawthorn polysaccharides; yam polysaccharides; monosaccharides; ultrasound; free radicals; antioxidant activity

收稿日期：2023-12-12

基金项目：河北省农业科技成果转化资金

作者简介：杨欣宇（1999—），女，硕士，研究方向：畜产科学。

*通信作者：高晓光（1984—），男，副教授，博士，研究方向：畜产科学。

山楂是一种药食同源、历史悠久的核果类水果，核硬皮薄，主要分布在中国北方地区。山楂果肉、果核和叶片中含有丰富的多糖、有机酸和维生素等功能性成分，具有较高的营养价值。山药也被称作薯蓣，是薯蓣科薯蓣属藤本植物，作为药食同源植物，富含多糖、黄酮和皂苷等活性成分，具有健脾、养肺和提高免疫力的作用。多糖是由多个单糖以不同比例的α或β糖苷键组成的聚合物，参与组成植物细胞壁，在自然界中广泛存在，对生物体的生命活动有着重要意义。植物多糖具有抗氧化、促进胃肠功能、保护肝脏和抑制肿瘤细胞生长等生理活性，副作用小，得到越来越多研究者的关注，在生活中的许多领域具有广阔的发展前景。提取方法直接影响植物多糖的提取率。传统热提取方法成本低、操作方便，但色素、蛋白质等物质易溶解，后续分离纯化难度大。酶法提取效率高、条件温和，但易受环境因素的影响。能耗低、耗时短的微波和超声辅助提取方法容易引起多糖降解。本研究以山楂和山药为研究对象，采用单因素试验和响应面法优化山楂多糖和山药多糖超声波辅助热水提取条件，检测其体外抗氧化能力，促进山楂和山药资源的充分合理利用，为提高山楂多糖和山药多糖的生物活性提供了理论参考。

1  材料与方法

1.1  材料与仪器

1.1.1  材料与试剂

试验所用山楂产自山东省，山药产自河北省保定市。

DPPH、硫酸亚铁、葡萄糖、无水乙醇、苯酚：天津市永大化学试剂有限公司；浓硫酸：广州市华迪化工有限公司；正丁醇、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250：北京索莱宝科技有限公司；过氧化氢、水杨酸、抗坏血酸：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.2  仪器与设备

FSJ302-5高速万能粉碎机  天津市泰斯特仪器有限公司；PS-40超声波清洗机  济南瑞莱铂智能科技有限公司；HH-4数显恒温水浴锅  华熙昕瑞（青岛）分析仪器有限公司；RE-52旋转蒸发器  上海亚荣生化仪器厂；LGJ-10D冷冻干燥机  四环福瑞科仪科技发展（北京）有限公司；UV-5800紫外分光光度计  上海元析仪器有限公司。

1.2  多糖的提取

1.2.1  原料预处理

将山楂清洗、去核后切片，烘干粉碎，过120目筛。

将山药清洗、去皮后切片，冻干粉碎，过120目筛。

1.2.2  多糖提取工艺流程

山楂、山药粉末→热水提取→离心→旋转蒸发→醇沉→冻干→粗多糖。

1.3  多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。葡萄糖标准曲线方程为y=13.867 8x+0.028 6，R2=0.998。

多糖得率（%）=C×V×NM×103×100%。

式中：C为多糖样品溶液的浓度（mg/mL）；V为定容体积（mL）；N为稀释倍数；M为山楂或山药样品的质量（g）。

1.4  多糖蛋白质含量的测定

使用Savage法重复脱蛋白8次，得到脱蛋白的粗多糖提取物，按照SN/T 3926—2014中的考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。蛋白质标准曲线方程为y=6.71x+0.014，R2=0.998。式中：y为595 nm处的吸光度值，x为牛血清蛋白的浓度（mg/mL）。

1.5  多糖单糖组分的测定

1.5.1  多糖的水解

称取一定量的多糖样品，加入1 mL 2 mol/L 三氟乙酸（TFA）溶液，于120 ℃加热2 h。用氮气吹干，用甲醇溶液洗涤，再次吹干，反复3次，用超纯水复溶即可获得多糖水解液。

1.5.2  色谱条件

采用Thermo ICS-5000+离子色谱仪测定单糖组成，液相色谱柱选用DionexTM CarboPacTM PA20离子色谱柱。

1.6  单因素试验

选取4个试验因素浸提温度、超声时间、料液比和浸提时间，讨论其对多糖提取率的影响，试验参数见表1和表2。

1.7  响应面试验

以多糖提取率作为响应值，以超声时间、料液比、浸提温度为考察因素，利用响应面法设计试验，具体因素水平值见表3和表4。

1.8  抗氧化活性分析

1.8.1  多糖清除DPPH自由基能力测定

参考Yang等的方法，测定样品在517 nm处的吸光度。

1.8.2  多糖清除羟基自由基能力测定

参考陈灼娟等的方法，测定样品在510 nm处的吸光度。

1.8.3  多糖清除ABTS自由基能力测定

参考刘羽婷等的方法，测定样品在734 nm处的吸光度。

1.9  试验数据分析

每组试验重复3次，结果表示为平均值±标准差。使用Design-Expert 11.1.1.0软件进行响应面分析，使用SPSS 21.0软件进行数据处理，使用Origin 2019软件绘图。

2  结果与分析

2.1  多糖的单糖组成

13种单糖标准混合溶液的色谱图见图1，山楂多糖和山药多糖水解液的色谱图分别见图2和图3。根据出峰时间，定性分析单糖组成。山楂多糖的单糖组成及比例为岩藻糖∶鼠李糖∶阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖∶木糖∶半乳糖醛酸∶甘露糖醛酸为0.48∶2.77∶11.02∶3.57∶56.02∶1.11∶22.70∶2.33；山药多糖的单糖组成及比例为半乳糖∶葡萄糖∶甘露糖醛酸为0.26∶95.49∶4.25。其中，葡萄糖是山楂和山药多糖中含量最高的单糖，分别占比56.02%和95.49%。

2.2  单因素试验

由图4可知，当浸提温度从40 ℃升至80 ℃时，山楂多糖提取率呈现先增加后减少的趋势，与王杨等的研究中提取温度对油茶籽多糖提取率的影响的变化趋势一致。当浸提温度为70 ℃时，山楂多糖提取率达到最大值47.53%。温度升高有利于多糖析出，温度过高会造成多糖结构降解，提取率大幅降低，故选择超声波辅助热水提取山楂多糖的浸提温度为70 ℃。当浸提温度从50 ℃升至70 ℃时，山药多糖提取率持续上升，最高可达12.97%，浸提温度持续上升，提取液中的淀粉糊化，多糖提取率和纯度受到干扰，故选择超声波辅助热水提取山药多糖的浸提温度为70 ℃。

由图5可知，当超声时间从10 min延长至30 min时，山楂多糖提取率高达45.42%。随着超声时间的继续增加，提取率显著降低，长时间超声处理破坏了多糖的分子结构，故选择超声波辅助热水提取山楂多糖的超声时间为30 min。超声属于弹性机械波，有利于加强溶剂分子的运动，从而提高溶剂在溶质中的传播速度。当超声时间从10 min延长至50 min时，山药多糖提取率呈现先上升后下降的趋势，40 min时山药多糖提取率达到最大值，故选择超声波辅助热水提取山药多糖的超声时间为40 min。

由图6可知，当料液比从1∶10 增至1∶25时，水的占比逐渐升高，气泡与样品间的界面面积也不断增加，细胞壁中活性成分更容易释放，因此，山楂多糖提取率逐渐增加，最大值为48.27%。继续增加料液比到1∶30，料液比过大，影响后续工作效率，多糖提取率降低，故选择超声波辅助热水提取山楂多糖的料液比为1∶30。当料液比从1∶15增至1∶30时，山药多糖提取率显著升高，继续增大料液比，山药多糖提取率下降，与李杰等研究料液比对山楂叶多糖得率的影响单因素试验中的变化趋势一致。过多的溶剂致使后续旋蒸等操作困难，工作量增加，故选择超声波辅助热水提取山药多糖的料液比为1∶30。

由图7可知，当浸提时间从60 min增至120 min时，山楂多糖提取率显著升高，120 min后随着浸提时间的延长，山楂多糖提取率没有显著变化，这与门志雯等研究的提取时间对山楂多糖得率的影响的变化规律一致。长时间高温会影响多糖活性，故选择超声波辅助热水提取山楂多糖的浸提时间为120 min。当浸提时间从90 min增至180 min时，山药多糖提取率持续上升，高达12.96%。随着浸提时间的继续延长，山药多糖提取率变化不大，多糖得率趋近稳定，大部分多糖已经溶出，浸提时间的延长对多糖提取率的影响不显著，故选择超声波辅助热水提取山药多糖的浸提时间为180 min。

2.3  山楂多糖响应面试验

山楂多糖响应面试验结果见表5，方差分析结果见表6。

通过回归拟合，获得山楂多糖提取率（Y）与自变量（超声时间、料液比、浸提温度）的二次多项式回归方程：Y=48.6－0.502 8A－0.409 1B+1.30C+0.493 6AB－0.284 6AC+1.45BC－2.05A2－2.84B2－4.14C2。回归模型的P＜0.01，失拟项的P=0.278 8＞0.05，无显著性影响，该模型与试验结果的拟合程度较好。影响山楂多糖提取率的因素有超声时间、料液比和浸提温度，其中浸提温度（C）的影响最大，超声时间（A）的影响次之，料液比（B）的影响最小。

由表6和图8可知，AB、AC和BC之间的交互作用对山楂多糖提取工艺的影响不显著（P＞0.05）。

通过求解回归方程，获得超声波辅助热水提取山楂多糖的最佳条件为超声时间28.26 min、料液比1∶24.77（g/mL）、浸提温度71.54 ℃，此条件下山楂多糖提取率理论预测值为48.81%。在此条件下进行3次验证试验，得到山楂多糖提取率的平均值为49.09%，与理论预测值相差0.28%，表明回归模型具有参考价值。

2.4  山药多糖响应面试验

山药多糖响应面试验结果见表7，方差分析结果见表8。

通过回归拟合，获得山药多糖提取率（Y′）与自变量（超声时间、料液比、浸提温度）的二次多项式回归方程：Y′=12.9+0.101 8A′+0.476 0B′+0.346 0C′－0.102 5A′B′－0.341 0A′C′－0.273 5B′C′－1.06A′2－0.842 9B′2－1.35C′2。回归模型的P＜0.01，失拟项（P=0.719 0）不显著，该模型与试验结果的拟合程度较好，具有统计学意义。影响山药多糖提取率的因素有超声时间、料液比和浸提温度，其中超声时间（A′）>料液比（B′）＞浸提温度（C′）。

由表8和图9可知，A′B′、A′C′和B′C′之间的交互作用对山药多糖提取工艺的影响不显著（P＞0.05）。

通过求解回归方程，获得超声辅助热水提取山药多糖的最佳条件为超声时间42.60 min、料液比1∶30.49（g/mL）、浸提温度70.18 ℃，此条件下山药多糖提取率的理论预测值为12.98%。经验证，山药多糖提取率的平均值为12.81%，与理论预测值相差0.17%，表明回归模型有效、可靠。

2.5  抗氧化活性

自由基清除能力是评估抗氧化性最常用的方法。试验过程中，DPPH自由基与抗氧化物快速、灵敏地相互作用；多糖与ABTS自由基发生反应，致使蓝色络合物的颜色变澄清；H2O2作为活泼的氧化过程的中间产物，象征着样品对活性氧的清除能力。在特定波长下测量以评估多糖的抗氧化能力。

研究结果表明，在特定范围内，多糖浓度与其自由基清除能力之间存在良好的线性关系，由图10～图12可知，多糖浓度越大，清除3种自由基的能力越强。当多糖浓度为0.5 mg/mL时，山楂多糖和山药多糖对DPPH自由基的清除率分别为80.58%和60.23%，对ABTS自由基的清除率分别为97.61%和66.64%，对羟基自由基的清除率分别为68.4%和50.46%。该研究证明了多糖浓度与抗氧化活性之间的显著关系，山楂多糖和山药多糖的抗氧化能力都很强，山楂多糖的抗氧化能力显著优于山药多糖，在天然抗氧化剂的开发利用中具有潜在价值。

3  结论

采用单因素试验和响应面法确定超声波辅助热水提取多糖的最佳工艺参数，山楂多糖最佳提取参数为超声时间28 min、料液比1∶24.8（g/mL）、浸提温度71.5 ℃、浸提时间120 min，此条件下提取率为49.09%。山药多糖最佳提取参数为超声时间42 min、料液比1∶30 （g/mL）、浸提温度70.0 ℃、浸提时间180 min，此条件下提取率为12.81%，与理论预测值无显著性差异（P＞0.05），模型有效可行。山楂多糖的单糖组成及比例为岩藻糖∶鼠李糖∶阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖∶木糖∶半乳糖醛酸∶甘露糖醛酸为0.48∶2.77∶11.02∶3.57∶56.02∶1.11∶22.70∶2.33；山药多糖的单糖组成及比例为半乳糖∶葡萄糖∶甘露糖醛酸为0.26∶95.49∶4.25。研究表明，山楂多糖具有更强的自由基清除能力。本文获得了超声波辅助热水提取多糖的最佳工艺，且证实山楂多糖和山药多糖具有较强的抗氧化活性，为山楂多糖和山药多糖的工业化提取提供了理论依据，）为多糖生物活性研究提供了参考。

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