低温对民猪骨骼肌线粒体能量代谢基因的影响

张冬杰 马守正 汪亮 李忠秋 刘娣

doi：10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.001

https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.001

收稿日期：2022-11-08  修回日期：2023-02-08

基金项目：国家自然科学基金（32172696）；黑龙江省省属科研院所科研业务费项目（CZKYF2021-2-C025）；国创中心先导科技项目（NCTIP-XD/C16）。

第一作者：张冬杰，女，研究员，研究方向为民猪资源保护研究与利用。E-mail：djzhang8109@163.com

通信作者：刘  娣，女，博士，教授，研究方向为地方猪资源保护研究与利用。E-mail：liudi1963@163.com

摘  要  为了探究低温环境下民猪肌肉组织内与线粒体能量代谢相关基因的变化情况，以解析民猪抗寒特性的遗传机制。将9头体质量相近的母猪随机分成3组，每组3头，在冬季将其中2组置于室外半敞篷舍内饲养，分别处理3 d（急性低温处理组）和58 d（慢性低温处理组），1组置于常规舍内饲养，作为对照组。以背肌为试验材料，采用PCR array方法，对90个与线粒体能量代谢相关基因的表达水平进行检测。结果表明，与对照组相比，急性低温处理组基因的表达水平差异不显著，但慢性低温处理显著改变  ATP5H、  ATP5L、  ATP6V1G3、  COX5A、  COX7A2、  COX7A2L、  NDUFS4、  SDHB、  UQCRQ和  GADD45B基因的表达水平，尤其是  GADD45B，达到了极显著水平（P<0.01），这些基因均为编码OXPHOS系统亚基基因，推测慢性低温诱导了背肌ATP的生成。对  GADD45B基因进一步分析发现，该基因在哺乳动物中高度保守，基本符合分子进化规律，表达具有明显的组织特异性。急性低温处理对民猪背肌内ATP的生成影响不显著，但慢性低温处理诱导ATP的生成，以维持体温恒定。

关键词  民猪；骨骼肌；低温；线粒体；能量代谢

线粒体是细胞的能量工厂，通过氧化呼吸链为生物体提供95%的能量。线粒体氧化磷酸化过程中产生的能量一部分作为ATP直接被生物体利用以支持某些能量消耗过程，比如肌肉运动、胞内离子运输等，剩余部分则主要作为热能维持体温。人们发现不同气候条件下动物对热量的需求并不相同，其线粒体受到纯净化选择压力也不同［1］。

适应性产热（adaptive thermogenesis）对恒温动物至关重要，是维持核心体温恒定的关键组成部分。当机体遭遇低温刺激时，除棕色脂肪外，骨骼肌也是重要的产热组织。它一方面可以通过肌肉的舒张和收缩产生热量，当细胞质中的Ca2+浓度升高时，肌肉会收缩，反之则舒张［2］。Ca2+的转运主要由肌质网钙离子ATP酶 （sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase， SERCA） 完成，它在转运Ca2+时，会水解一个ATP，释放热量，同时将两个Ca2+从细胞质泵回肌质网［3］。另一方面，肌肉线粒体中受调节的氧化磷酸化解偶联也可发挥产热作用［4］。冷驯化可以增加骨骼肌中线粒体的体积，这可能是通过Ca2+刺激线粒体生物发生产生的［5］。

猪是较为特殊的一种哺乳动物，新生仔猪对温度的敏感性要大于牛、羊等其他新生家畜。但猪的  UCP1基因在进化过程中发生了突变，使其无法产生传统意义上的棕色脂肪［6］。因此，寒冷环境下，猪是通过何种方式维持体温恒定一直是未知的。相比之下，同样发生  UCP1基因突变而无法产生棕色脂肪的鸟类，其低温环境下的能量代谢机制的研究较为透彻［7］。对于鸟类，已经明确骨骼肌是其在低温环境下的重要产热组织［8］，但猪由于相关研究报道较少，目前还无法确认肌肉和脂肪哪个是其重要产热组织，或者是两者兼具。但无可争议的是，长期冷暴露或短期急性冷暴露均会导致机体产热能力的增加，这是恒温动物维持体温、调节内稳态的关键［9］。

本研究以一种东北地区特有的民猪作为研究对象，该地方猪因长期生活在寒冷地区，具有明显的抗寒特性［10］。使用PCR array技术对遭受慢性低温处理和急性低温处理的民猪背肌进行与线粒体能量代谢相关基因的筛选与分析，以期解析低温环境下民猪骨骼肌线粒体的能量代谢变化情况。

1  材料与方法

1.1  试验材料

9头体质量为（60±5） kg的民猪母猪由黑龙江省农业科学院畜牧研究所民猪养殖场提供。

1.2  试验设计

2020年11月9日，试验开始前，9头个体均在供暖的猪舍内饲养，舍内温度控制在（18±2） ℃。将9头个体随机分成3组，每组3头。试验开始后，随机将一组置于室外半敞篷舍内饲养，记为慢性低温处理组，半敞篷舍内温度与外界环境温度基本一致，白天最高温度为5 ℃，夜晚最低温度为-5 ℃。试验进行55 d后，将剩余2组的1组置于室外半敞篷舍内饲养，记为急性低温处理组，此时白天最高温度降为-15 ℃，夜晚最低温度为-24 ℃。再处理3 d后，试验结束。整个试验期内，3组个体均自由采食，保证充足的饮水。试验结束后，将9头个体同时屠宰，采集背肌、背脂、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等组织，置于液氮中保存，备用。

1.3  总RNA的提取与反转录

使用Trizol分别提取每个个体不同组织的总RNA，微量分光光度计进行纯度检测，1%琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的浓度和完整性，质量浓度要求不低于100 ng/μL。使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒将所提取的总RNA反转录成cDNA。

1.4  PCR array分析

猪线粒体能量代谢PCR array孔板订制于上海沃吉基因科技有限公司，每个PCR array为一个96孔板，内含90个目的基因和3个内参基因以及3个阴性对照。阵列中所含的90个目的基因信息见表1。3个内参基因分别为ACTB、GAPDH和  HPRT1。

1.5  实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

96孔板中含有目的基因的引物，因此只需配置其他qRT-PCR反应成分，包括cDNA样品0.5 μL，WCGENE mRNA qPCR mix （2×）5.3 μL，灭菌水3.2 μL。反应程序为：95 ℃ 30 s；40个循环：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。检测结果根据2-ΔΔCt法计算不同低温处理组目的基因相较于对照组的表达量变化情况，按照|log2FC|>1且P<0.05的标准筛选差异基因。

1.6    GADD45B基因的克隆测序与分子进化树构建

使用Primer 5.0软件，根据NCBI数据库中已有的  GADD45B基因序列（XM_005654701）设计引物，用于扩增该基因的完整编码区，引物序列为GS：5′-ATGACACTGGAAGAGCTCGTGG-3′，GA：5′-CAGCGTTCCTGGAGGGAGAT-3′。获得民猪  GADD45B基因的完整编码区序列后，使用DNAMAN软件与已知序列进行比对，确定所扩增序列的准确性。使用NCBI数据库的在线软件BLAST，下载人、鼠、恒河猴、牛、羊、鸡、家燕、鳄鱼、青蛙和斑马鱼的GADD45B氨基酸序列。使用MEGA 11.0软件对这些氨基酸序列进行整理和比对，并构建基于GADD45B氨基酸序列的分子进化树。

1.7   GADD45B基因的组织表达谱

采用qRT-PCR的方法，检测  GADD45B基因在民猪的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、背肌和背脂中的表达水平。所用引物序列为AS：5′- GCTGATGAATGTGGACCCT -3′，AA：5′- AAACGACTGGATGAG GGTG -3′。选择β-actin基因作为内参基因，引物序列为F：5′-CGGGACCTGACCGACTACCT-3′，S：5′- GGGCCGTGATC TCCTTCTG -3′。qRT-PCR反应条件和反应程序同“1.5”。将该基因在肾脏的表达水平设为对照，其他组织与其相比较，判定表达水平高低，相对表达量的计算公式为2-△△Ct，其中△△Ct=（△Ct目的基因-△Ct内参基因）其他组织-（△Ct目的基因-△Ct内参基因）心脏。

2  结果与分析

2.1  慢性低温处理后肌肉组织线粒体能量代谢相关基因的变化

线粒体能量代谢阵列共包含90个目的基因，以ATP酶H+/K+转运、ATP合成、细胞色素C氧化酶、 泛醌氧化还原酶（NADH）、琥珀酸脱氢酶复合体、泛醌细胞色素c还原酶等家族基因为主。民猪在遭受慢性低温处理后，背肌内与线粒体能量代谢相关的90个基因，按照|log2FC|>1且P<0.05标准进行差异表达基因筛选，共10个基因发生显著上调，其中  ATP5H、  ATP5L、  ATP6V1G3、  COX5A、  COX7A2、  COX7A2L、  NDUFS4、  SDHB和  UQCRQ显著上调（P<   0.05），  GADD45B极显著上调（P<  0.01），未发现显著下调的基因（图1）。

2.2  急性低温处理后肌肉组织线粒体能量代谢相关基因的变化

民猪在遭受急性低温处理后，背肌内与线粒体能量代谢相关的90个基因，按照|log2FC|>1且P<0.05标准进行差异表达基因筛选，未发现发生显著变化的基因（图2）。说明急性低温处理没有显著改变背肌内线粒体能量代谢。

2.3    GADD45B基因的克隆测序

使用引物对GS和GA，获得民猪  GADD45B基因完整编码区序列，共计483 bp，编码160个氨

基酸。通过BLAST比对，下载NCBI数据库中人（NP_056490.2）、鼠（NP_032681.1）、恒河猴（NP_001247803.1）、牛（NP_001035694.1）、羊（XP_004008677.1）、鸡（XP_040548737.1）、家燕（XP_039942460.1）、鳄鱼（XP_019393972.1）、青蛙（XP_040178585）和斑马鱼（NP_001012386）的GADD45B氨基酸序列。经比对发现，该基因在哺乳动物中高度保守，序列一致性达97.81%，在不同物种间属于中度保守，序列一致性为  81.99%（图3）。

2.4  基于GADD45B氨基酸序列构建分子进化树

利用MEGA11.0软件构建基于不同物种GADD45B氨基酸序列的分子进化树（图4）。哺乳动物中，猪与牛、羊的亲缘关系最近，人和恒河

猴的亲缘关系最近，哺乳动物聚在一个大的分支上。家燕和鸡同为鸟类，它们的亲缘关系最近，但斑马鱼、鳄鱼和青蛙在进化树上的位置与它们的进化地位并不相符。斑马鱼作为鱼类，应处于该进化树的最低端，其次是两栖类的青蛙，然后是爬行类的鳄鱼和鸟类。

2.5   GADD45B基因在不同组织的表达

以民猪的肾脏组织为参照，利用相对定量的计算方法，比较  GADD45B基因在民猪不同组织的表达情况（图5）。发现该基因具有明显的组织表达特异性，在背肌和心脏中表达量非常低，其次是背脂，但在脾脏中表达量非常高，肺脏和肝脏次之。

3  讨  论

骨骼肌具有很强的代谢灵活性和适应能力，能够对不同能量需求的环境信号作出反应［10］。骨骼肌细胞中的线粒体通过氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）产生细胞行使功能所需的大部分能量，并参与许多关键的细胞过程，如凋亡、钙稳态和产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。热应激会改变骨骼肌细胞的糖酵解，在ATP需求突然增加后，补偿性糖酵解机制被激活。热应激诱导的热休克蛋白70 （HSP70）抑制OXPHOS，同时促进糖酵解以补偿ATP失衡［11］。目前关于细胞和分子对冷胁迫适应的复杂机制研究较少。此前发现，将小鼠的C2C12成肌细胞暴露在低温下会增加代谢通量，分化肌管通过增加代谢率、ATP产生和糖酵解通量［12］来应对低温。

本研究发现，短期的急性低温处理（3 d）并未显著改变这些基因的表达水平，而长期的慢性低温处理（58 d）显著诱导了与ATP合成相关基因的表达。线粒体ATP的产生是由OXPHOS系统介导的，该系统由4个线粒体多亚基复合体（CⅠ、CⅡ、CⅢ和CⅣ）和F0F1-ATP合成酶（CⅤ）组成。民猪在遭受长期低温处理后，多个参与编码该系统亚基的基因发生了显著上调，其中  NDUFS4是编码CⅠ亚基的基因，CⅠ是4个复合体中最大最复杂的一个蛋白，线粒体内大多数ATP是经过CⅠ的电子传递产生的［13］。在乳鼠的心肌细胞中敲减  NDUFS4，会造成ROS水平上升，线粒体膜电位、钙离子摄取能力、细胞最大呼吸速率均出现下降，说明该基因在维持线粒体正常功能方面具有重要作用［14］。上调表达的  SDHB是编码CⅡ亚基的基因，它既可参与ATP的生成，也可影响细胞内线粒体的数量［15］。编码CⅢ亚基的  UQCRQ基因，编码CⅣ亚基的  COX5A、  COX7A2和  COX7A2L基因，也发生了显著上调。CⅣ负责将电子从细胞色素C传递到分子氧。电子传递与ATP合成是偶联在一起的，即氧化磷酸化过程。此外，编码F0F1-ATP合成酶亚基的3个基因，即  ATP5H、  ATP5L和  ATP6V1G3也发生了显著上调，ATP合成酶在呼吸过程中通过电子传递链（electron transport chain，ETC）释放的能量先转换为跨膜质子（H+）梯差，之后质子流顺质子梯差通过ATP合成酶使ADP+Pi合成ATP［16］。这些基因的显著上调，说明低温处理下，民猪骨骼肌线粒体内的ATP合成增加了。

对发生极显著上调表达的  GADD45B基因进一步分析发现，该基因在正常情况下的脾脏中高表达，这与其参与TH1介导的免疫应答相关，该基因的缺失，会导致小鼠脾脏显著增大［17］。本研究中，民猪在遭受慢性低温处理后，骨骼肌中的  GADD45B基因发生了极显著的上调，具体作用机理未知。目前已知  GADD45B是肌肉发生的重要调控因子，它的缺失可降低p38 MAPK的磷酸化水平，从而下调肌肉调节因子（muscle regulatory factors，MRFs）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1Α（PPARGC1A）的表达，导致肌源性分化和线粒体生物发生的抑制［18］。此外，该基因还参与细胞的DNA修复和抗凋亡。

4  结  论

民猪是一个具有明显抗寒特性的地方猪种，通过PCR array技术高通量筛选了不同程度的低温处理下民猪骨骼肌线粒体能量代谢相关基因的变化情况。发现急性低温处理并未改变民猪骨骼肌内线粒体能量代谢相关基因的表达，但慢性低温处理诱导了多个编码OXPHOS系统的亚基基因，包括  ATP5H、  ATP5L、  ATP6V1G3、  COX5A、  COX7A2、  COX7A2L、  NDUFS4、  SDHB和  UQCRQ基因（P<0.05），以及发生极显著变化的  GADD45B基因（P<0.01），推测这些基因的上调表达将最终实现ATP合成的增加。发生极显著变化的  GADD45B基因，氨基酸序列在哺乳动物中高度保守，基本符合分子进化规律，表达具有明显的组织特异性。

参考文献  Reference：

［1］  SUN Y B，SHEN Y Y，IRWIN D M，et al.Evaluating the roles of energetic functional constraints on teleost mitochondrial-encoded protein evolution［J］.Molecular Biology and Evolution，2011，28（1）：39-44.

［2］  MACLENNAN D H，KRANIAS E G.Phospholamban： a crucial regulator of cardiac contractility［J］.Nature Reviews Molecular Cell Biology，2003，4（7）：566-577.

［3］  TOYOSHIMA C，NAKASAKO M，NOMURA H，et al.Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 A resolution［J］.Nature，2000，405（6787）：647-655.

［4］  MAHALINGAM S，CHEVIRON Z A，STORZ J F，et al.Chronic cold exposure induces mitochondrial plasticity in deer mice native to high altitudes［J］.The Journal of Physiology，2020，598（23）：5411-5426.

［5］  MAURYA S K，HERRERA J L，SAHOO S K，et al.Sarcolipin signaling  promotes  mitochondrial biogenesis and oxidative  metabolism in skeletal  muscle［J］.Cell Reports，2018，24（11）：2919-2931.

［6］  HOU L，SHI J，CAO L，et al.Pig has no uncoupling protein 1［J］.Biochemical and Biophysical Research Communication，2017，487（4）：795-800.

［7］  SWANSON D L，ZHANG Y，JIMENEZ A G.Skeletal muscle and metabolic flexibility in response to changing energy demands in wild birds［J］.Frontiers in Physiology，2022，3：961392.

［8］  NOWACK J，GIROUD S，ARNOLD W，et al.Muscle non-shivering thermogenesis and its role in the evolution of endothermy［J］.Frontiers in Physiology，2017，8：889.

［9］  TATE K B，WEARING O H，IVY C M，et al.Coordinated changes across the O2 transport pathway underlie adaptive increases in thermogenic capacity in high-altitude deer mice［J］.Proceedings  Biological Sciences，2020，287（1927）：20192750.

［10］  杨月莹，刘  娣.民猪耐寒基因目标风险最小特征搜索［J］.西北农业学报，2013，22（10）：15-21.

YANG Y  Y，LIU D.Screening for anti freezing genes in pig with target risk minimized feature searching algorithm［J］.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2013，22（10）：15-21.

［11］  WESTERBLAD H，BRUTON J D，KATZ A.Skeletal muscle：energy metabolism，fiber types，fatigue and adaptability［J］.Experimental Cell Research，2010，316：3093-3099.

［12］  SAJJANAR B，SIENGDEE P，TRAKOOLJUL N，et al.Cross-talk between energy metabolism and epigenetics during temperature stress response in C2C12 myoblasts［J］.International Journal of Hyperthermia，2019，36（1）：776-784.

［13］  LITTLE A G，SEEBACHER F.Thermal conditions experienced during differentiation affect metabolic and contractile phenotypes of mouse myotubes［J］.American Journal of Physiology Regulation，Integrative and Comparative Physiology，2016，311： R457-R465.

［14］  李凤杰，沈丽君，方合志，等.线粒体呼吸链复合体Ⅰ［J］.中国细胞生物学学报，2014，36（8）：1153-1161.

LI F J，SHEN L J，FANG H ZH，et al.Mitochondrial respiratory  complex I［J］.Chinese Journal of Cell Biology，2014，36（8）：1153-1161.

［15］  李  杰，王爱玲，杨谋广.低表达NADH脱氢酶［辅酶Q］铁硫蛋白4对乳鼠心肌细胞线粒体功能的影响［J］.安徽医学，2017，38（8）：959-962.

LI J，WANG A L，YANG M G.Effect of low expression of protein   NDUFS4 on mitochondria function of ventricular myocytes in neonatal rats［J］.Anhui Medical Journal，2017，38（8）：959-962.

［16］  陈立兰，狄  文.琥珀酸脱氢酶B亚基对卵巢癌细胞线粒体DNA拷贝数影响的研究［J］.现代妇产科进展，2022，31（3）：161-165.

CHEN L L，DI W.Study on the effect of succinate dehydrogenase B subunit on the mitochondrial DNA copy number in ovarian cancer cells［J］.Progress in Obstetrics and Gynecology，2022，31（3）：161-165.

［17］  ZHAO R Z，JIANG S，ZHANG L，et al.Mitochondrial   electron transport chain，ROS generation and uncoupling （Review）［J］.International Journal of Molecular Medicine，2019，44（1）：3-15.

［18］  DENG K，FAN Y，LIANG Y，et al.FTO-mediated demethylation of   GADD45B promotes myogenesis through the activation of p38 MAPK pathway［J］.Molecular Therapy-Nucleic Acids，2021，26：34-48.

Effect of Low Temperature on Mitochondrial Energy Metabolism Genes in Skeletal Muscle of Min Pig

ZHANG Dongjie， MA Shouzheng， WANG Liang， LI Zhongqiu and LIU Di

（Institute of Animal Husbandry， Heilongjiang Academy of Agricultural Science，Harbin  150086，China）

Abstract  In order to explore the changes of genes related to mitochondrial energy metabolism in muscle tissue of Min pigs under low temperature environment， and to analyze the genetic mechanism of cold resistance of Min pigs.Nine female Min pigs with similar mass  were randomly divided into three groups， with three individuals in each group.In winter， two groups of individuals were raised in outdoor semi-open houses for 3 days （acute low temperature treatment group） and 58 days （chronic low temperature treatment group）， respectively， and one group was raised in normal houses as the control group.The expression level of 90 genes related to mitochondrial energy metabolism in the skeletal muscle of Min pig was detected by PCR array method.The acute low temperature treatment did not significantly change the expression levels of these genes， but chronic low temperature treatment significantly changed the expression levels of   ATP5H，   ATP5L，   ATP6V1G3，   COX5A，   COX7A2，   COX7A2L，   NDUFS4，   SDHB，   UQCRQ and   GADD45B genes at a very significant level （P<0.01）， especially   GADD45B.These genes were all genes encoding OXPHOS system subunits，  suggesting that chronic low temperature treatment induced ATP production.Further analysis of   GADD45B gene showed that the gene was highly conservative in mammals， basically in line with the molecular evolutionary law， and its expression had obvious tissue specificity.Acute low temperature treatment did not change the ATP production in skeletal muscle of Min pig， but the chronic low temperature treatment induced ATP production to maintain body temperature constant.

Key words  Min pig; Skeletal muscle; Low temperature; Mitochondrial; Energy metabolism

Received   2022-11-08    Returned  2023-02-08

Foundation item  The National Natural Science Foundation of China （No.32172696）; Scientific Research Fund for Heilongjiang Provincial Research Institutions （No.CZKYF2021-2-C025）; National Center of Technology Innovation for Pigs （No.NCTIP-XD1C16）.

First author  ZHANG Dongjie， female， research fellow.Research area： research and protection of the Min pig.E-mail： djzhang8109@163.com

Corresponding   author  LIU Di， female， Ph.D，professor.Research area： research and protection of the indigenous pig breeds.E-mail：liudi1963@163.com

（责任编辑：顾玉兰  Responsible editor：GU Yulan）