超高效液相色谱-串联质谱法同时测定地锦草中8种成分的含量

郑璇杏 张煜帆 佘溢彬 郑婧婧 郭漫炫

【摘要】目的：建立超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）用于同时测定地锦草中2种有机酸类和6种黄酮类成分的含量。方法：采用Hypersil GOLD C18（150 mm×3.0 mm，3μm），流动相为0.3%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，流速为0.3 mL/ min，柱温为40℃，进样量为2μL；质谱采用ESI源，负离子模式监测，喷雾电压为-3000 V，离子化温度为500℃，多反应监测模式（MRM）用于定量分析。结果：所测定地锦草中的8个成分在测定浓度范围内峰面积和浓度均呈良好的线性关系（r≥0.9910），加样回收率在96.1%～99.9%，精密度、重复性和稳定性良好并符合方法学考察要求。结论：该方法简便、快速、准确、可靠，可用于地锦草中8种成分的含量测定。

【关键词】地锦草；UPLC-MS/MS；有机酸；黄酮；含量

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.03.011

Simultaneous Determination of Eight Components in Euphorbiae Humifusae Herba by UPLC-MS/MS

ZHENG Xuanxing， ZHANG Yufan， SHE Yibin， ZHENG Jingjing， GUO Manxuan

（Chaozhou Institute for Drug Control， Chaozhou 521000， China）

Abstract： To develop a UPLC-MS/MSmethod for simultaneous determination of six flavonoids and two organic acids in Euphorbiae Humifusae Herba. Methods：The analysis was performed on a Hypersil GOLD C18 column （150 mm×3.0 mm，3μm） at 40℃. The mobile phase was 0.3% formic acid solution （A）-hexanenitrile （B） in a gradient elution， which was delivered at a flow rate of 0.3 mL/ min. The injection volume was 2μL. For the MS/MS analysis， the ESI source was operated in the negative-ion mode and the ions were monitored in multiple reaction monitoring （MRM） mode. The ionization temperature was 500℃，and the spray voltage was controlled at -3000 V. Result：Calibration curves showed good linearity for all 8 compounds in the settingconcentration （r≥0.9910）. The recovery rate was 96.1%～99.9%. The precision， repeatability， stability were all conformed to the validated requirements of methodology. Conclusion： The method simple and convenient， quick， celerity， precise and reliable， can be used for determination of above 8 compounds in Euphorbiae Humifusae Herba.

Keywords： Euphorbiae Humifusae Herba； UPLC-MS/MS； organic acid； flavonoid； content

地锦草是中药中常用的草本药材，主要来源于大戟科植物地锦和斑地锦的干燥全草部分。其常用于中药、维吾尔药、蒙药等民族药中，具有较高的研究价值。地锦草具有清热解毒、凉血止血、利湿退黄的作用，用于痢疾、泄泻、咯血、尿血、便血、崩漏、疮疖痈肿、湿热黄疸等症状[1-2]。地锦草主要含黄酮类、有机酸类、萜类与香豆素类等成分，其中有机酸类和黄酮类为地锦草主要活性成分，为没食子酸、鞣花酸、异槲皮苷、紫云英苷等[3-4]。没食子酸具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤生物活性，对心血管系统疾病、神经系统疾病、糖尿病、肝纤维化和肿瘤等具有防治作用[5]；异槲皮苷具有抗炎抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂、神经保护等生物活性[6]；鞣花酸具有抗肿瘤、抗突变、抗菌抗病毒等活性[7]；紫云英苷具有显著促进成骨细胞增殖和分化的活性，抑制卵巢癌细胞增殖和侵袭[8-9]；槲皮素具有抗氧化、保护器官及细胞、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗焦虑和抗抑郁、免疫调节、抗糖尿病等药理活性[10]；木犀草素和山柰酚有抗癌、抗炎、抗氧化、保护神经、防治骨质疏松、保护肝脏和心肌等多种药理活性[11-12]。

2020年版《中华人民共和国药典》中“地锦草质量标准”只规定了槲皮素的含量限度，评价成分较单一。文献中多采用高效液相色谱（HPLC）方法或者超高效液相色谱（UPLC）方法测定地锦草中有机酸类或黄酮类含量，最多只检测出4种成分[13-16]，而采用UPLC-MS/MS同时测定地锦草中有机酸类和黄酮类等8个活性成分的研究未见报道。本研究采用UPLCMS/MS技术，对4批地锦草药材中没食子酸、芦丁、异槲皮苷、鞣花酸、紫云英苷、木犀草素、槲皮素、山柰酚8个成分进行同步含量测定，该方法简便快速准确，以期为地锦草的质量控制及开发利用提供一定的参考依据。

1仪器与材料

1.1仪器

LC-30A超高效液相色谱仪（日本岛津公司），Triple Quad 3500三重串联四级杆质谱仪（美国ABSciex公司），SQP电子天平（赛多利斯科学仪器〔北京〕有限公司），AL204电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），FW100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），GT-1990QTS智能超声波清洗机（广东固特超声股份有限公司），SorvallST16R高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技〔中国〕有限公司）。

1.2材料

没食子酸对照品（批号110831-201605，纯度90.8%）、芦丁对照品（批号100080-201811，纯度91.7%）、异槲皮苷对照品（批号111809-201904，纯度97.2%）、鞣花酸对照品（批号111959-201903，纯度88.8%）、木犀草素对照品（批号111520-202006，纯度94.4%）、槲皮素对照品（批号100081-201610，纯度99.1%）、山柰酚对照品（批号118061-201611，纯度95.5%）均购自中国食品药品检定研究院；紫云英苷对照品（批号：Y10J10H79707，纯度98%）购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯，默克公司）、甲酸（色谱纯，赛默飞世尔科技〔中国〕有限公司）。4批地锦草产地分别为：浙江（上海康桥中药饮片有限公司，批号190531）、湖北（湖北金贵中药饮片有限公司，批号A190601）、广东（康美药业股份有限公司，批号 191103160）、广东（康美药业股份有限公司，批号180402001）。这些地锦草经鉴定为大戟科植物地锦的干燥全草。

2方法与结果

2.1液相和质谱条件

液相条件：色谱柱为Hypersil GOLD C18柱（150 mm×3.0 mm，3μm）；流动相：0.3%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序：0～2.0 min，95%A；2.0～9.0 min，95%A～10%A；9.0～11.0 min，10%A；11.0～11.1 min，10%A～95%A，11.1～13.0 min，95%A。流速：0.2 mL/min。柱温：40℃。进样量：2μL。

质谱条件：离子源为ESI，喷雾电压（IS）为-3000 V，离子化温度（TEM）为500℃，气帘气（CUR）为35 psi，碰撞气（CAD）为Medium，雾化气（GS1）为55 psi，辅助加热气（GS2）为55 psi，检测方式为负离子检测（Negative），扫描模式为多反应检测模式（MRM）。质谱检测参数见表1，提取的定量离子色谱图见图1。

2.2溶液制备

2.2.1对照溶液制备

精密称取没食子酸对照品10.24 mg、芦丁对照品11.80 mg、异槲皮苷对照品10.05 mg、鞣花酸对照品18.78 mg、紫云英苷对照品10.56 mg、槲皮素对照品10.96 mg，分别置于10 mL的容量瓶中，加入甲醇适量，超声溶解并定容至刻度，摇匀；精密称取木犀草素对照品11.86 mg、山柰酚对照品11.16 mg分别置于100 mL的容量瓶中，加入甲醇适量，超声溶解并定容至刻度，摇匀；即得对照贮备液。

精密量取没食子酸对照品贮备液0.50 mL、芦丁对照品贮备液0.20 mL、异槲皮苷对照品贮备液0.50 mL、鞣花酸对照品贮备液2.00 mL、紫云英苷对照品贮备液0.40 mL、木犀草素对照品贮备液0.40 mL、槲皮素对照品贮备液0.25 mL、山柰酚对照品贮备液1.00 mL置于25 mL溶液，用甲醇定容，即得混合对照品溶液（每1 mL含有没食子酸18.60μg，芦丁8.656μg异槲皮苷19.54μg，鞣花酸133.4μg，紫云英苷16.56μg，木犀草素1.791μg，槲皮素10.86μg，山柰酚4.263μg）。

2.2.2供试品溶液的制备

称取地锦草粉末（过三号筛）0.2 g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞称质量，超声处理60 min（频率40 kHz，功率300 W），放冷称质量，加80%甲醇补足减失的质量，摇匀，7500 r/min离心10 min，用0.22μm的微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.3方法学验证

2.3.1线性关系考察

取2.2.1项混合对照品溶液适量，将对照品溶液分别稀释2、5、10、20、100、200倍，得系列浓度的混合对照品溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤后按2.1项色谱条件进样2.0μL，以峰面积为噪声10倍（S/N=10）时的进样浓度为定量限（LOQ）。8种成分的线性关系见表2。

2.3.2精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液2.0μL，按2.1项液相和质谱条件连续进样测定6次，以对照品峰面积进行计算，结果8个成分峰面积的RSD分别为0.7%、1.9%、1.4%、0.9%、1.4%、0.8%、1.4%、1.8%，表明仪器精密度良好。

2.3.3重复性试验

精密称取批号190531地锦草样品6份，按2.2.2项方法平行制备供试品溶液，按2.1项液相和质谱条件进样分析，根据样品峰面积计算8个成分的含量。结果其含量的RSD分别为0.6%、0.9%、1.3%、1.2%、1.2%、2.1%、1.6%、2.4%，表明本法重复性良好。

2.3.4稳定性试验

精密称取批号19053地锦草样品，按2.2.2项方法制备供试溶液，室温放置，在0、2、4、6、8、10、12 h进样分析，根据样品峰面积计算8种成分的含量。结果其含量的RSD分别为1.5%、1.5%、1.7%、1.9%、1.7%、3.0%、3.0%、3.9%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.5加样回收率试验

精密称取已测知8种物质含量批号19053地锦草样品粉末0.1 g共6份，分别加适量对照品溶液，按2.2.2项方法制备供试溶液，按2.1项液相和质谱条件进样分析，分别计算8个成分的平均回收率及其RSD，结果见表3。

2.3.6样品含量测定

精密称取4批样品，按2.2.2项下方法制备样品溶液，按2.1项液相和质谱条件进样分析，测定其8种成分的含量，结果见表4。

3讨论

3.1液相和质谱条件的优化

分别考察甲醇、乙腈、超纯水、甲酸、甲酸铵等不同比例的流动相体系的分离效果。结果表明，有机相为乙腈时，响应值偏高，故选用乙腈为有机相。为改善待测组分色谱峰的峰形，流动相中加入一定量的酸，分别加入0.1%、0.2%、0.3%、0.5%甲酸溶液，发现0.3%甲酸水溶液时各组分峰型比较好，最终确定以0.3%甲酸-乙腈为流动相，并对其进行优化建立梯度洗脱程序。

在研究离子扫描模式时采用正负模式发现，有机酸类及黄酮类成分实验在正负离子监测下都能测定，但是在负离子条件下检测响应强于正离子条件，因此选择负离子反应监测。鞣花酸和紫云英苷的定量子离子质荷比相同，但是其母离子质荷比不同且通道不同，不影响各自的定量分析。

3.2药材提取方法优化

以甲醇和乙醇为提取溶剂，考察冷浸法（24 h）、超声提取法和加热回流法对地锦草样品中8种成分提取量的影响。结果表明，采用超声提取法和加热回流法提取效果差不多，因此采用操作方便的超声提取法，溶剂为甲醇时的提取效果较好。考察不同的提取溶剂（50%、80%、100%的甲醇）提取时间（30 min、45 min、60 min、90 min）对提取效果的影响，确定最佳提取方法为80%甲醇超声提取60 min。

4结束语

本文建立了UPLC-MS/MS法同时测定4批地锦草药材中没食子酸、芦丁、异槲皮苷、鞣花酸、紫云英苷、木犀草素、槲皮素、山柰酚8种成分的含量，为地锦草的质量控制及开发利用提供一定的参考依据。

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【作者简介】

郑璇杏，女，1989年出生，学士，研究方向为化妆品和药品检验。

（编辑：侯睿琪）