羊李氏杆菌病的鉴别与检测检疫方法

张精海

摘要：羊李氏杆菌病是羊只感染单核细胞增多性的李氏杆菌从而引发的传染病，又称转圈病。患病羊只表现为发热至40.5～41℃、行动迟缓、头向一侧倾斜、随意转圈、头颈高抬、角弓反张、四肢划水状等，若未及时治疗或误诊会导致羊只的死亡。本文对羊李氏杆菌病的临床症状进行了综述，分别介绍了羊李氏杆菌病的实验室诊断方法和与其他病的鉴别诊断方法，并总结了检测方法，以期广大养殖场能够更好地预防羊李氏杆菌病的发生，降低羊只的伤亡率和养殖场的经济损失。

关键词：羊；李氏杆菌；临床症状；鉴别诊断；检测方法

羊李氏杆菌病是由革兰氏阳性的、不形成芽孢和荚膜的李氏杆菌导致的传染病，各年龄阶段的羊只均可感染，但羔羊的发病率更高。羊李氏杆菌病一年四季均可发生，根据患病羊只的年龄阶段可以分为羔羊、成年羊以及妊娠母羊，具有低发病率、高死亡率的特点，也属于人畜共患病之一，因此一旦患病会给养殖业和消费者安全健康造成极大的隐患，因此在养殖过程中必须给予高度的重视，本文对羊李氏杆菌病的临床症状、实验室诊断方法、鉴别诊断以及检测方法进行了总结，具体内容如下：

1 临床症状

不同年龄阶段的羊只患病后表现出的临床症状不同，可以具体分为：羔羊、成年羊及妊娠母羊三种。

1.1 羔羊

羔羊感染羊李氏杆菌病后通过表现出典型、明显的临床症状，即表现为急性败血症，非常高的死亡率。具体表现为：体温升高至41 ℃，交替出现精神萎靡和突然兴奋，共济失调（行走站立不稳），漫无目的地游走或者不停地转圈，头部向后仰的观星状态，角弓反张，尖叫，四肢划水，有白色的泡沫状液体从口腔中流出，面部、颈部肌肉僵直且过段时间可恢复，虽食欲不受影响但由于肌肉痉挛而导致不能采食到口中，根据患病羔羊自身体质病程可持续1～3周。

1.2 成年羊

成年绵羊感染此病的概率高于成年的山羊，羊只感染羊李氏杆菌后病程缓慢。具体表现为：多数羊只有创伤存在于口腔中，体温正常，精神萎靡，采食下降或停止，贫血导致可视黏膜苍白，角膜浑浊，有分泌物存在于眼睑部位，视力减退甚至完全失明，之后伴随神经症状，遇到障碍后停滞不前且依靠从而导致偏瘫，连续转圈，眼睑及患病侧耳朵下垂，有未咀嚼的饲料存储在口腔中且流涎，全身麻痹，直至卧地不起，四肢划水，最终死亡。

1.3 妊娠母羊

妊娠期母羊感染羊李氏杆菌后出现流产和子宫炎，虚脱，昏迷，麻痹，直至死亡，有些妊娠母羊未表现出任何症状就突然死亡。病程7 d左右。

2 实验室诊断和鉴别

2.1 实验室诊断

1）剖检。工作人员在做好防护的情况下，对患病死亡的羊只进行解剖，可以观察到明显的病变。心脏：心外膜点状出血；肝脏：肿大、变性，不同形状（米粒状、散在或者成片）的坏死灶、出血点存在于其表面；胃肠道：黏膜充血、出血；脾脏：出血点存在其表面且明显肿大；肾脏：存在出血点；淋巴结：全身淋巴结肿大、出血，肠系淋巴结尤为严重；脑部：脑、脑膜等部位水肿、充血，炎性病变，增多而浑浊的脑脊液，脑干软化，存在一些坏死灶，中脑、延脑有脓性肿胀以及管套；鼻腔：鼻炎，流出呈黏脓性的鼻液；对于妊娠后流产的母羊，解剖后可观察到子宫有面积较大的充血和坏死灶，大量脓性渗出物存在于胎盘顶端且胎盘绒毛坏死[1]。

2）镜检。首先，在无菌环境中，采集死亡羊只的肝脏或者脾脏，然后使用干净牙签将样品涂抹至载玻片中，接着进行染色，使用的是瑞特氏和革兰氏染料，再使用光学显微镜进行观察，可以观察到革兰氏阳性、两端钝圆、粗短、菌体细小、无芽孢、无荚膜、以单个或者成对方式存在的菌体。

3）实验室培养。首先采集样品，在无菌环境中，采集患病后死亡羊只的肝脏或者脾脏作为培养样品均可；然后按照样品∶生理盐水＝1∶5的比例对样品进行研磨，并接种在肝片肉汤和血液琼脂培养基中，血液琼脂培养基需要的条件为：厌氧、有氧、温度37 ℃、培养1～3 d，此时有圆形、透明、大小似针尖、表面光滑的菌落出现在其中，且菌落周围存在溶血环，在透光且随着培养时间的延长，菌落由蓝灰色变成灰白色，由透明变为不透明。而肝片肉汤培养基中有轻微的浑浊出现但不存在气泡；接着，对可疑菌落进行染色，并分别在浓度为0.05%和0.1%的亚硫酸钠血液琼脂中进行接种，培养条件为：37 ℃、1～3 d，此时0.05%的亚硫酸钠血液琼脂中可以观察到：灰白色菌落且菌落颜色在3 d后变为红色；0.1%的亚硫酸钠血液琼脂可以观察到：黑色菌落。最后在血清葡萄糖甘油肉汤、浓度为10%的氯化钠血清葡萄糖甘油琼脂中分别接种典型菌落，培养条件为37 ℃、1～3 d。前者培养基中观察到：略微浑浊、底部出现黏稠的沉淀物，震荡时先出现螺旋状上升后表现为颗粒状，未形成菌环和菌膜；后者培养基中观察到：圆形、透明、针尖大小、光滑、淡蓝色的菌落，逐渐变为不透明、灰白色的菌落。

4）运动性诊断。取出血清葡萄糖甘油肉汤中的培养物，并穿刺接种在半固体培养基中22 ℃培养3 d，菌体运动并沿着穿刺线以倒立松树的形状生长至两侧；接着在37 ℃培养3 d，这时可以发现菌体停止运动，但仍旧沿着穿刺线两侧生长[2]。

2.2 鉴别诊断

羊只感染李氏杆菌后具有一些与其他疾病相似的症状，故在生产中需要进行鉴别诊断。

1）绦虫病。当羊只感染绦虫病后，也会偶尔出现转圈、旋回、卧地不起等症状。但是可以通过检查粪便进行区别，粪便中可以观察到绦虫节片，对死亡羊只进行剖检，可以观察到胃肠道中存在虫体。

2）包虫病。当羊只感染脑包虫病后，也会出现颈部向一侧倾斜，精神萎靡和亢奋交替出现，转圈，痉挛等，可能与羊李氏杆菌病混淆。但是，若是脑包虫病则体温正常，病程较长，寄生虫存在于羊只头部导致头骨软化、松软，剖检时脑膜中存在虫体。

3）伪狂犬病。当羊只患伪狂犬病后，会出现神经过度兴奋，转圈，头部向一侧倾斜，头部抵墙或者依靠障碍物。但是与羊李氏杆菌病也存在一些差异，如体温忽然升高，全身被毛脱落严重，咽喉、皮肤均出现水肿，有泡沫状的液体从口腔中流出，病程较短，一般1～2 d即可死亡。

3 检测方法

使用恰当、准确的检测方法及时进行检测，并根据检测结果采取相关预防措施，可以有效降低羊李氏杆菌的危害。其中，常用的检测方法包括传统检测、免疫学检测以及分子生物学检测。

3.1 传统检测

传统检测主要指的是细菌分离培养。此检测方法具有成本低廉、可定量、可定性的优势，但是也存在检测速度慢、影响因素较多等缺点。具体操作为：先在无菌条件下采集患病羊只的病料组织，然后放在专门的培养基中进行培养，并将所长的菌落进行生化反应、运行性检查、溶血试验、血清型鉴定等，最终确定检测结果。

3.2 免疫学检测

常见的免疫学检测方法分为：胶体金免疫技术、酶联免疫吸附法等。

1）胶体金免疫技术。此方法具有快速、灵敏度高、时间短、简便等优势。其原理是利用胶体金作为标记物的一种常见的免疫学检测方法。江玲丽等[3]使用柠檬酸钠法研制出了李氏杆菌溶血素的胶体金试纸，研究发现此试纸具有较强的特异性、较高的稳定性和灵敏度、较好的亲和力（常数为4.25×108 L/mol），检测时间只需15 min，与PCR检测结果、国际检测方法的符合率为91.67%。

2）酶联免疫吸附法。此方法具有方便、标准化程度高等优势，也是在李氏杆菌检测中应用最广的方法。随着科技的进步和检测技术的不断成熟，酶联免疫吸附法的检测时间由最初的2～3 d缩短至几小时，加快了检测速度，缩短了时间。

3.3 分子生物学检测

常见的分子生物学检测方法包括：PCR技术、重组酶聚合酶扩增技术、免疫磁珠分离与PCR结合法等。

1）PCR技术。此技术具有重复使用、可靠等优点，且具有可以与其他技术结合以提高检测结果灵敏性、特异性的优势。王一明等[4]使用PCR技术对新疆伊犁地区280个绵羊血液等指标通过设计特异性引物、提取DNA、确定反应条件、分析扩增结果等步骤，检测出5个样本中含有李氏杆菌。

2）基于测流层析的重组酶聚合酶扩增技术。此技术具有检测时间短、特异性好、结果直观、所需仪器设备简单等优势。其原理是探针5'段具有荧光基团、反向引物被生物素标记，从而使得产物既有荧光基团又有标记物从而利用测流层析法进行检测。王亚磊等[5]通过设计、合成引物，提取单核细胞李氏杆菌细菌基因组，筛选RPA最佳引物，测定RPA-LF灵敏度和特异性等步骤建立了产单核细胞李氏杆菌的RPA-LF快速检测方法，此方法适合快速的现场检测、野外检测。

3）免疫磁珠分离与PCR结合法。此方法具有检测时间短、特异性强等优势，但是需要专业的检测人员、操作较为复杂、应用范围窄。其原理是用核酸探针为基础然后进行斑点杂交实验。

4 小结

羊李氏杆菌严重威胁各阶段羊只尤其是羔羊的生命健康，春秋季发病率高，死亡率高，因此会威胁整个羊群的健康，未及时治疗或者治疗不当会造成较大的损失。养殖户在饲养过程中要通过专业的实验室诊断、鉴别、检测准确判断此病，以便采取及时有效的治疗和预防措施，做到及早发现、及时治疗、科学预防，保证羊群的健康生长。

参考文献：

[1] 傅雯婕.羊李氏杆菌病流行病学及诊治[J].畜牧兽医科学（电子版），2020（3）：120-121.

[2] 朱凤民.羊李氏杆菌病的临床症状、实验室检查、鉴别及防治[J].现代畜牧科技，2017（6）：91.

[3] 江玲丽，高有领，胡兴娟，等.检测产单核细胞李氏杆菌溶血素的胶体金试纸条制备及初步应用[J].畜牧兽医学报，2022，53（6）：1841-1848.

[4] 王一明，张海兰，杨菊清，等.伊犁地区绵羊李氏杆菌病PCR诊断方法的建立[J].中国草食动物科学，2013，33（4）：53-55.

[5] 王亚磊，张海洋，王权，等.产单核细胞李氏杆菌RPA-LF快速检测方法的建立[J].中国兽医科学，2020，50（1）：1-9.