高效降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选及其在腊肉中的应用

罗皓 付伟阳 曹敏 孙在兴 何昌伟 李玉锋

摘要：从四川传统腊肉中分离出14株乳酸菌菌株，其中7株可高效降解亚硝酸盐；对比其发酵特性，选取TrLb-4为目标菌株，经16S rDNA鉴定该菌株为短乳杆菌；通过分析接种短乳杆菌后腊肉的pH值、过氧化值、TBARS值、亚硝酸盐残留量、挥发性风味物质组成，探究其对腊肉品质和安全性的影响。结果表明，接种短乳杆菌后腊肉的pH值有所降低；试验组的亚硝酸盐残留量显著减少，仅为7%（P<0.05）；气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析结果显示：试验组共检出53种风味物质，与对照组主体风味成分存在差异，醛类物质占比降低，醇类、酯类和酮类物质占比有所增加。综合分析可得，菌株TrLb-4可以有效降解亚硝酸盐，抑制腊肉的脂肪氧化，促进特征风味物质的产生，对改善腊肉的品质、提高腊肉的食用安全性有显著作用。

关键词：腊肉；亚硝酸盐；乳酸菌；风味物质

中图分类号：TS201.3

文献标志码：A

文章编号：1000-9973（2024）06-0091-06

Screening of Lactic Acid Bacteria for Efficient Degradation of

Nitrite and Their Application in Bacon

LUO Hao， FU Wei-yang， CAO Min， SUN Zai-xing， HE Chang-wei， LI Yu-feng^*

（School of Food and Bioengineering， Xihua University， Chengdu 610039， China）

Abstract： Fourteen strains of lactic acid bacteria are isolated from traditional Sichuan bacon， among which， 7 strains can efficiently degrade nitrite. Through comparing their fermentation characteristics， TrLb-4 is selected as the target strain， which is identified as Lactobacillus brevis by 16S rDNA. By analyzing the pH value， peroxide value， TBARS value， residual amount of nitrite and volatile flavor substance composition of bacon after inoculation with Lactobacillus brevis， its effects on the quality and safety of bacon are explored. The results show that the pH value of bacon decreases after inoculation with Lactobacillus brevis. The residual amount of nitrite in the experimental group significantly decreases， which is only 7% （P<0.05）. The analysis results of gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） show that a total of 53 flavor substances are detected in the experimental group， which are different from the main flavor components in the control group.The proportion of aldehydes decreases， while the proportion of alcohols， esters and ketones increases. Through comprehensive analysis， it can be concluded that strain TrLb-4 can effectively degrade nitrite， inhibit fat oxidation of bacon， and promote the production of characteristic flavor substances， which has a significant effect on improving the quality and edible safety of bacon.

Key words： bacon; nitrite; lactic acid bacteria; flavor substances

收稿日期：2024-01-12

基金项目：四川省科技厅重大项目成果转化（17NZZH0026）

作者简介：罗皓（1998—），男，硕士研究生，研究方向：食品科学。

*通信作者：李玉锋（1965—），男，教授，博士，研究方向：食品生物技术。

四川腊肉作为传统腌制类制品，主要以滋味咸香、色泽鲜亮为特点。为了提升腊肉的品质，多采用工业化生产，亚硝酸盐作为工业化生产常用的食品添加剂，可以在腌制过程中促进脂质氧化，提高醛类物质的积累，从而带来特有的腌制风味；同时可以很好地抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长^[1]。然而长期摄入亚硝酸盐存在安全隐患，甚至会引发癌症^[2]。由于亚硝酸盐在肉制品发酵中作用较大，目前难以被替代。因此，控制腊肉中亚硝酸盐的残留量十分重要。

目前降解亚硝酸盐的方法主要分为3种：物理降解法、化学降解法、生物降解法。研究指出，乳酸菌接种发酵可以有效降低泡菜中的亚硝酸盐含量^[3]。张庆芳等^[4]研究表明，亚硝酸盐的降解分为酶降解和酸降解两个阶段，在pH高于4.5时，主要以酶降解为主，当pH降低到4.0以下主要以酸降解为主；乳酸菌可以将碳水化合物分解成乳酸，降低pH，在发酵过程中构建酸性环境，抑制食品腐败和致病微生物生长的同时，促进亚硝酸盐的降解。葛芮瑄等^[5]研究表明，乳酸菌利用糖类分解成乳酸的同时伴随着乙酸、丁酸、3-羟基-2-丁酮等小分子风味物质的形成，在抑制腐败、降解亚硝酸盐的同时赋予了风味。杨慧轩等^[6]指出不同乳酸菌之间的合理组合会提高产品质量和抑菌效果。可见，将乳酸菌发酵运用到肉制品加工中，可以起到改善产品风味、抑制氧化酸败、降解亚硝酸盐和生物胺、延长产品保质期等作用^[7]。因此，本研究旨在筛选出发酵特性优良且具有工业发酵潜力的乳酸菌，为后续腊肉生产工艺优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料试剂与仪器设备

1.1.1 材料试剂

腊肉：采集自四川成都、内江传统农家腊肉样品4份。

对氨基苯磺酸、乙酸锌、盐酸萘乙二胺、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、吐温80、牛肉浸粉、亚硝酸钠：福晨（天津）化学试剂有限公司；氢氧化钠、硼砂、亚铁氰化钾、磷酸二氢钠、MnSO₄·H₂O：天津市津东天正精细化学试剂厂；所有试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器设备

BSA423S电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TGL-16台式高速冷冻离心机 四川蜀科仪器有限公司；BPG-9070A精密鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；GI54DWS全自动高压蒸汽灭菌锅 致微（厦门）仪器有限公司；GCMS-QP2020 NX气相色谱-质谱（GC-MS）联用仪 日本岛津公司。

1.2 试验方法

1.2.1 农家腊肉中乳酸菌的分离与纯化

称取腊肉样品各10 g，在无菌条件下加入90 mL无菌生理盐水，使用破壁机将其打碎。将上述样液分别加入MRS液体培养基中，于37 ℃培养48 h^[8]。

取上述发酵液样品，稀释3个梯度后，取0.2 mL涂布于添加3% 碳酸钙的MRS固体培养基中，于37 ℃培养48 h^[9]，挑取具有溶钙圈的单一菌落，在MRS培养基中重复分离纯化培养3次，得到纯化后的菌株，于-20 ℃甘油中保存^[10]。

1.2.2 降解亚硝酸盐菌株的初筛

亚硝酸盐培养基：配制150 mg/L的亚硝酸盐溶液，按照1∶9的比例加入已灭菌的MRS培养基中混匀^[11]。

将各菌株按1%的接种量接种于10 mL亚硝酸盐培养基中，于37 ℃培养48 h，采用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐残留量^[12]。

1.2.3 菌株生长曲线的测定

将活化菌株以2%的接种量接种于MRS液体培养基中，于37 ℃培养48 h，每隔2 h测定培养液的OD_{600 nm}值。

1.2.4 发酵液pH值的测定

将活化菌株以2%的接种量接种于MRS液体培养基中，于37 ℃培养24 h^[13]，每隔4 h测定发酵液的OD_{600 nm}值。

1.2.5 菌株耐盐试验

将活化菌株按照2%的接种量分别添加于含有6.5%、10% NaCl的MRS液体培养基中^[14]，于37 ℃培养48 h，测定发酵液的OD_{600 nm}值。

1.2.6 乳酸菌分子生物学鉴定

采用细菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA，作为模板，参考刘建利等^[15]的方法，PCR扩增16S rDNA基因序列，并委托上海凌恩生物科技有限公司进行测序。将测序序列提交至美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库，采用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行同源性对比鉴定。

1.2.7 制作工艺流程

材料：猪肉、乳酸菌、亚硝酸钠、食盐；组别设置：添加菌液组为试验组，传统发酵组为对照组。

原料肉处理：选择新鲜的猪五花肉，切割成规则的形状（长约20 cm，宽为5～7 cm），使用白酒洗净。

辅料添加：加入辅料并充分揉搓，对照组和试验组均采用传统工艺，试验组菌液采用注射器注射进肌肉。

腌制：将处理好的肉块在腌缸中腌制72 h。

风干、发酵熟成：按照烘干加工条件，将肉块置于烘干机内，以50 ℃烘制32 h至肉块呈半干状态后移入室外悬挂、通风，使之继续发酵成熟。

1.2.8 水分含量的测定

参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》方法测定样品中水分含量。

1.2.9 pH值的测定

参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》方法，选取腊肉样品中瘦肉部分测定pH值^[16]。

1.2.10 过氧化值的测定

参照GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》方法测定样品的过氧化值。

1.2.11 TBARS值的测定

参照GB 5009.181—2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》，采用分光光度法测定样品中TBARS值。

1.2.12 亚硝酸盐残留量的测定

参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》方法测定样品中亚硝酸盐残留量。

1.2.13 腊肉挥发性风味物质的测定

精确称取肥瘦均匀的腊肉样品5 g于顶空瓶中，于60 ℃水浴加热40 min、吸附30 min、解吸5 min。

参考王卫等^[17]的方法并做一定修改，气相色谱（GC）条件：采用HP-5MS毛细管柱（30.0μm×250μm×0.25μm），载气为He，恒定流速为1 mL/min，进样口温度为220 ℃，以不分流方式进样。柱箱采用程序升温，初始温度50 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升温到110 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升温到250 ℃，保持5 min。

质谱（MS）条件：色谱、质谱的接口温度为250 ℃，质谱电子方式为EI，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，溶剂延迟2 min。电子倍增器电压1 600 V，数据以30～300 amu的扫描范围进行收集。

1.3 数据处理

采用GraphPad Prism 9.5绘制柱状图、折线图和雷达图，使用SPSS 25.0进行显著性检验，当P＜0.05时被认为具有统计学意义，结果以平均值±标准差（x±s）表示。

2 结果与分析

2.1 降解亚硝酸盐乳酸菌的分离纯化

从四川不同地区采集的4份腊肉样品中共分离出18株革兰氏染色阳性疑似菌落，菌落呈乳白色或黄色，菌落直径在1～5 mm。其中14株菌落表面光滑湿润，边缘较规则，具有典型的乳酸菌特征^[18]，其余4株菌落结构差异较大且无溶钙圈，故初筛出14株乳酸菌^[9]，见图1。

由图1可知，14株菌株均具有亚硝酸盐降解能力，其中2，3，4，7，8，9，10号菌株的降解能力较强，其发酵液中亚硝酸盐残留量均低于5%，故选取这7株菌株进行后续试验。

2.2 高效降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选鉴定

2.2.1 菌株发酵特性的测定

由图2可知，对比发酵液的pH值，2，4，10号菌株的产酸能力更突出，发酵液的pH值较低，能在发酵过程中提供较好的酸性环境，抑制杂菌的生长，增加了菌株用于发酵的可能性^[10]。

由图3可知，4号和2号菌株的总体耐受力较强，在6.5%和10%盐浓度下4号菌株的耐受力均优于2号菌株，10号菌株在10%盐浓度下耐受力最强。如今腊肉多为低盐腊肉^[11]，盐分含量在6%以下，因此4号菌株更具有优势。

由图4可知，对比7株具有高效降解亚硝酸盐能力的菌株的产酸能力、生长曲线和盐耐性指标，最终筛选出生长发酵特性最优的4号菌株为目标菌株，将其编号为TrLb-4。

2.2.2 高效降解亚硝酸盐菌株分子生物学鉴定

采用分子生物学技术对TrLb-4菌株进行分子生物学鉴定，提取其DNA，进行16S rDNA基因序列PCR扩增，得到测序结果后在NCBI进行BLAST同源性序列比对，测序结果显示4号菌株为短乳杆菌，其生长发育树见图5。

2.3 高效降解亚硝酸盐短乳杆菌发酵应用

2.3.1 短乳杆菌发酵对腊肉理化性质的影响

由表1可知，试验组与对照组腊肉的含水量无显著差异。短乳杆菌TrLb-4发酵过程中对水分含量的影响并不突出，对腊肉的保存和货架期的影响不明显；试验组样品pH值相比对照组有所降低（P<0.05），酸性环境可以抑制腊肉中杂菌的生长及辅助降解亚硝酸盐，对提高腊肉的安全性具有积极作用^[19]，同时试验组的POV值与TBARS值均显著低于对照组（P<0.05），表明短乳杆菌TrLb-4发酵可以显著减缓腊肉中脂肪的氧化酸败^[20]，理论上可以减少不良气味的产生，提升腊肉的品质。

发酵完成后，试验组亚硝酸盐残留量显著低于对照组（P<0.05）。在试验中，为了模拟工厂腊肉生产条件，腌制过程中添加了15 mg/kg亚硝酸盐，在腊肉自然发酵过程中，亚硝酸盐分解速率缓慢，导致其大量残留于腊肉中，而试验组发酵后的亚硝酸盐残留量大幅降低，表明短乳杆菌TrLb-4可以高效降解腊肉中亚硝酸盐，提高腊肉的安全性。

2.3.2 短乳杆菌发酵对腊肉挥发性风味物质的影响

腊肉中挥发性风味物质含量见表2。

两组之间的主体风味物质存在差异，试验组共检测出挥发性风味物质53种，对照组共检测出挥发性风味物质56种，各挥发性风味物质含量对比见图6。

对照组风味物质主要为醛类物质，其占比达到56.24%，试验组中醛类物质含量为41.29%，相比对照组有所下降。醛类物质是发酵肉制品中的主要特征风味物质^[21]，其风味阈值较低，多由脂肪氧化分解产生，对腊肉的风味有重要影响，但含量较多会生成油腻和酸败的气味^[22]。

醇类物质主要来源于脂质的降解和氧化^[23]，通常带有果香、花香，阈值较高，对腊肉风味的整体影响较小，在发酵后期，醇类物质会与有机酸形成阈值较低、对风味贡献较大的酯类物质^[24-25]。试验组中醇类含量达到25.04%，其中桉叶油醇和芳樟醇含量较高，这两类物质具有一定的抑菌作用^[26]，同时对腊肉的风味形成也有贡献；对照组中酯类物质含量为11.14%，试验组中酯类物质含量有所提高，占比为14.79%，其中检出发酵肉制品特征风味物质丁酸乙酯^[27]。

酮类物质主要由发酵过程中不饱和脂肪氧化及氨基酸降解产生，含量相对较低，对腊肉风味起到增强作用^[28]；同样，烃类物质也可以提供特征风味，对腊肉的风味具有一定影响。试验组相比于对照组，酮类物质的种类和含量都有所增加；烃类物质含量差异较小，但种类不尽相同，其中具有刺激性气味的物质含量降低。

总体而言，试验组样品挥发性风味成分更丰富，这是由于短乳杆菌的发酵促进了蛋白质、脂肪和糖类成分等的分解^[8]，进而促进风味物质的产生，同时抑制脂肪酸败氧化，有效改善因醛类物质过多产生的负面影响。酯类、酮类和烃类物质的形成也进一步增强和改善了腊肉的风味^[5]。

3 结论

本研究从四川传统腊肉中分离出14株乳酸菌，对比其亚硝酸盐降解能力、盐耐受性、产酸能力等发酵特性，最终筛选出目标菌TrLb-4，经16S rDNA序列同源性分析，该菌株为短乳杆菌。发酵后，两组腊肉样品含水量无显著差异；试验组的pH值、过氧化值、TBARS值均有所降低（P<0.05），亚硝酸盐残留量显著低于对照组（P<0.01）；全二维GC-MS分析结果显示：试验组中共检测出53种挥发性风味物质，其中醛类物质占比减少，减轻了因大量醛类物质累积而带来的油脂酸败味；醇类、酯类和酮类物质占比增加，腊肉的特征风味得到增强；产生不悦气味的烃类物质减少，风味物质组成更丰富。综上所述，短乳杆菌TrLb-4可显著降低腊肉中亚硝酸盐残留量，减缓脂肪的酸败氧化，促进醇类、酯类和酮类物质产生，改善腊肉的风味，其在提高腊肉安全性的同时改善了腊肉的品质，可作为发酵腊肉的功能菌株应用到腊肉工业化生产中。

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