不同抗螨性板栗差异次生代谢物筛选与分析

收稿日期Received：2022-09-25""" 修回日期Accepted：2023-03-24

基金项目：河北省农林科学院农业科技创新专项（200KJCXZK-RW-5）；河北省科技计划（21326304D-3）；河北省自然科学基金项目（C2020301053）；河北省农林科学院科技创新专项（2022KJCXZX-CGS-2）。

第一作者：张馨方（971470601@qq.com），副研究员。

*通信作者：王广鹏（wangguangpeng430@163.com），研究员。

引文格式：

张馨方，王广鹏，张树航，等. 不同抗螨性板栗差异次生代谢物筛选与分析. 南京林业大学学报（自然科学版），2024，48（2）：234-240.

ZHANG X F， WANG G P， ZHANG S H， et al. Screening and analysis of differential secondary metabolites in Castanea mollissima" with different levels of resistance to Oligonychus ununguis . Journal of Nanjing Forestry University （Natural Sciences Edition），2024，48（2）：234-240.

DOI：10.12302/j.issn.1000-2006.202209053.

摘要：【目的】筛选分析抗螨性不同的板栗（Castanea mollissima）叶片中的差异次生代谢物，为抗螨机理解析与高抗螨板栗品种选育提供参考。【方法】以板栗品种‘燕兴’（‘Yanxing’）和‘丽抗’（‘Likang’）为材料，采用田间调查法进行抗螨性鉴定，确定‘燕兴’和‘丽抗’对针叶小爪螨的抗性等级；利用超高效液相色谱和串联质谱（UPLC-MS/MS）进行代谢组学检测，通过差异倍数（fold change）和VIP（variable importance in projection）值相结合的方法筛选差异代谢物，使用R软件ComplexHeatmap包和MetaboAnalystR包分别绘制聚类热图和OPLS-DA得分图；利用KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库对差异代谢物进行注释，并按通路类型分类。【结果】‘丽抗’和‘燕兴’对针叶小爪螨的抗性等级分别为1级（高抗）和7级（感）；两品种共检测到704个次生代谢物，筛选出差异代谢物165个，有73个代谢物在 ‘丽抗’中的含量显著高于‘燕兴’，有92个差异代谢物在‘丽抗’中的含量比‘燕兴’低；差异代谢物种类包括酚酸（56个）、黄酮（60个）、木质素和香豆素（19个）、鞣质（4个）、生物碱（5个）、萜类（16个）和其他类（5个），差异代谢物中黄酮和酚酸类占比较高，分别为36%和34%；仅在‘丽抗’中检测到的代谢物有7个，分别是咖啡酰胆、6′-O-反式肉桂酰-8-表金吉苷酸、落叶松脂素-4′-O-葡萄糖苷、阿尔本酚B、地榆素H11、3-羟基-5甲基苯酚-O-葡萄糖苷和苜蓿素-7-O-葡萄糖醛酸苷等；仅存在于‘燕兴’中的代谢物有15个，包括4-甲基-5-噻唑乙醇、2，4-二羟基苯甲酸、异嗪皮啶、水杨苷、刺梨酸等。‘燕兴’和‘丽抗’中有33个差异代谢物被注释到12条通路上。【结论】感螨品种‘燕兴’和高抗品种‘丽抗’次生代谢谱存在差异，可能与板栗抗螨性相关的次生代谢物有樱黄素、表没食子儿茶素、咖啡酸、阿魏酸、几种木质素以及4-甲基-5-噻唑乙醇；‘燕兴’和‘丽抗’的差异次生代谢物主要注释和富集在黄酮、黄酮醇生物合成及类黄酮生物合成通路。

关键词：板栗；针叶小爪螨；抗螨性；次生代谢物

中图分类号：S718；S763.3""""""" 文献标志码：A开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

文章编号：1000-2006（2024）02-0234-07

Screening and analysis of differential secondary metabolites in Castanea mollissima with different levels of resistance to Oligonychus ununguis

ZHANG Xinfang， WANG Guangpeng*， ZHANG Shuhang， LI Ying， GUO Yan

（Changli Institute of Pomology， Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Changli 066600， China）

Abstract： 【Objective】The differential secondary metabolites in chestnut （Castanea mollissima） leaves with different mite resistance levels were screened to provide a reference for the analysis of the mite（Oligonychus ununguis） resistance mechanism and the breeding of highly mite-resistant chestnut varieties.【Method】The chestnut varieties ‘Yanxing’ and ‘Likang’ were used to identify and determine the mite resistance levels to O. ununguis with the field investigation method. Metabolomics detection was performed using ultra-high-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry， and the differential metabolites were screened using a combination of fold change and the variable importance in projection value. The R software （ComplexHeatmap and MetaboAnalystR package） was used to draw the clustering heat map and orthogonal partial least squares-discriminant analysis score map. Identified metabolites were annotated using the Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） database， and the annotation results were classified by pathway types.【Result】The resistance levels of ‘Likang’ and ‘Yanxing’ to O. ununguis were high resistance and susceptible， respectively. A total of 704 secondary metabolites were detected， including 165 differential metabolites. The content of 73 metabolites in ‘Likang’ was significantly higher than in ‘Yanxing’， and the content of 92 metabolites was lower in ‘Likang’ than in ‘Yanxing’. The types of differential metabolites included 56 phenolic acids， 60 flavonoids， 19 lignins and coumarins， four tannins， five alkaloids， 16 terpenoids and five other types. Flavonoids and phenolic acids accounted for 36% and 34%， respectively. Metabolites present only in ‘Likang’ included caffeoylcholine-4-O-glucoside， 3-hydroxy-5-methylphenol-1-O-（6′-galloyl）glucoside， tricin-7-O-glucuronide， 6′-trans-cinnamoyl-8-epikingisidic acid， lariciresinol-4′-O-glucoside， albanol B and sanguiin H11. There were 15 metabolites present only in ‘Yanxing’， including 4-methyl-5-thiazoleethanol， 2，4-dihydroxybenzoic acid， isofraxidin， salicin and roxburic acid. Thirty-three differential metabolites in ‘Yanxing’ and ‘Likang’ were annotated to 12 metabolic pathways.【Conclusion】 The secondary metabolic profiles between the mite-susceptible variety ‘Yanxing’ and the highly resistant variety ‘Likang’ differed. Secondary metabolites that may be related to chestnut mite resistance were prunetin， epigallocatechin， caffeic acid， ferulic acid， several lignans and 4-methyl-5-thiazoleethanol. The differential secondary metabolites were mainly annotated and enriched in the flavonoid biosynthesis pathway and the flavone and flavonol biosynthesis pathway.

Keywords：Castanea mollissima； Oligonychus ununguis；mite resistance；secondary metabolites

板栗（Castanea mollissima）为中国驯化利用最早的果树之一，果实香甜糯俱佳，植株抗逆、耐瘠薄性强，在山区栽培分布极广，也是我国现阶段为数不多的具有出口优势的树种之一。针叶小爪螨（Oligonychus ununguis）隶属于叶螨科（Tetranychidae）小爪螨属（Oligonychus），又名栗红蜘蛛，是板栗生产上最主要的虫害之一。该虫多集中在叶片正面吸食汁液，造成叶片失绿、呈现灰白色枯斑，甚至全叶变褐干枯失去正常生理功能，严重影响板栗的产量和品质。目前生产上对针叶小爪螨的防治仍以化学药剂为主，易造成环境污染，且杀伤天敌昆虫，不利于绿色生产。选育和应用抗螨性强的板栗品种是从根本上预防和控制针叶小爪螨为害的有效措施。

抗虫性是植物与昆虫协同进化过程中形成的遗传特性，明确植株抗虫性是虫害有效治理策略中的重要环节。代谢组学以代谢产物为研究对象，对植物特定组织中的整体代谢水平进行比较，全面、高效而准确，广泛应用于植物的品质鉴定、生理代谢、功能成分挖掘及抗性种质筛选等领域。近年来，植物次生代谢物在抗虫性方面的研究备受关注，证实其对植食性昆虫具有引诱、驱避、毒杀、拒食等作用。目前已知与抗虫性有关的主要次生物质有15 000多种。李菁等发现萜烯类植物挥发物对舞毒蛾（Lymantria dispar）成虫具有良好的诱集效果；左彤彤等研究发现不同品系杨树中的咖啡酸、肉桂酸和丁香酸对青杨脊虎天牛（Xylotrechus rusticus）有明显驱避效果；杨振德等研究证实苦豆子生物碱及其单体对柳蓝叶甲（Plagiodera versicolora）具有较强的拒食作用。

目前，关于抗螨板栗品种已有报道，亦证实了不同品种对针叶小爪螨的抗性有显著差异。雷恒久等通过研究板栗叶片的形态特征和组织结构，从物理防御层面初探了板栗对针叶小爪螨的抗性机制。但整体来说业界对于板栗抗螨性机制的研究极少，而基于代谢组学层面的板栗抗螨机制研究鲜见报道。本研究选取生产实践上对针叶小爪螨抗性有显著差异的2个代表性品种，首先进行抗螨性验证，再通过代谢组学技术解析2个品种之间的次生代谢物差异，从而为板栗抗螨机理解析和高抗螨品种培育提供参考。

1" 材料与方法

1.1" 试验材料

以多年生产实践证实的抗螨板栗品种‘丽抗’（‘Likang’）和感螨板栗品种‘燕兴’（‘Yanxing’）为材料，试材取自河北省农林科学院昌黎果树研究所板栗品种比较园（119°15′E， 39°72′N），砧木、树龄及栽培管理措施一致。试验地属中国东部季风区暖温带半湿润大陆性气候，年均气温12.2" ℃，年均降水量643 mm，年均日照2 663.7 h，海拔20 m，砂壤土。2021年8月，同品种随机选取生长势基本一致健康树3株，取每株树冠外围营养枝上20片叶混合在一起为1次生物学重复，做3次重复。叶片用冰盒带回实验室后即刻清除昆虫等杂质，液氮速冻后置于-80" ℃超低温冰箱保存备用。

1.2" 抗螨性指标测定

参考《板栗种质资源描述规范和数据标准》，对针叶小爪螨的抗螨性鉴定采用田间调查法。每品种选取生长势基本一致的健康树体10株，其中5株为调查树，5株为对照树，调查树与对照树相距12 m左右，中间设两列植株作为保护行、保护株隔离。调查树在整个生长季节不进行病虫害防治，对照树根据针叶小爪螨发生时期，叶面喷施稀释1 000倍螨死净（杭州庆丰农化有限公司）控制害螨数量，达到有虫不成灾。2021年8月初调查针叶小爪螨为害情况，每株树随机调查营养枝50片叶的失绿面积，叶片失绿面积共分为5级，划分标准见表1。

根据失绿等级计算失绿指数，计算公式为：

I = ∑（x×n）X×N×100%。

式中：I为失绿指数；x为失绿等级代表值；n为对应失绿等级的叶片数；X为最高失绿等级代表值；N为总叶片数。板栗对针叶小爪螨的抗性等级分为：1级，高抗（I＜15%）；3级，抗（15%≤I＜25%）；5级，中抗（25%≤I＜35%）；7级，感（35%≤I＜60%）；9级，高感（I≥60%）。

1.3" 次生代谢物检测

将样品置于冻干机（Scientz-100F，宁波新芝）进行真空冷冻干燥，剪碎后再利用研磨仪（MM 400，Retsch，德国）在30 Hz条件下研磨1.5 min；称取100 mg粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中，于4 ℃冰箱过夜，其间涡旋混匀；之后以转速12 000 r/min离心10 min，吸取上清液，用孔径0.22 μm的微孔滤膜（SCAA-104，ANPEL公司，上海）过滤，滤液用于超高效液相色谱和串联质谱分析（UPLC，Exera X2，SHIMADZUN，日本；MS，QTRAP 4500，SCIEX，美国）。次生代谢组学检测由武汉迈特维尔生物科技有限公司完成。

基于迈维自建数据库（Metware database），根据二级谱信息进行物质定性，代谢物定量则利用三重四级杆质谱的多反应监测模式（multiple reaction monitoring）分析完成。

1.4" 统计分析

利用Excel 2010进行数据整理，分别使用R 2.8.0 ComplexHeatmap包和R 1.0.1 MetaboAnalystR包绘制聚类热图和OPLS-DA得分图。利用KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库对差异代谢物进行注释，对注释结果按照KEGG通路类型进行分类，利用R 3.5.1 barplot软件包绘制KEGG分类图。

1.5" 差异代谢物筛选

基于OPLS-DA得分结果，从获得的多变量分析OPLS-DA模型的变量重要性投影（variable importance in projection，VIP），初步筛选差异代谢物，同时结合单变量分析的差异倍数（fold change，FC）值来进一步筛选出差异代谢物。代谢物应满足FC值≥2.0或FC值≤0.5，同时VIP值≥1.0才被认定是差异代谢物。

2" 结果与分析

2.1" ‘燕兴’和‘丽抗’的抗螨性鉴定

调查发现，板栗‘燕兴’和‘丽抗’调查树的失绿指数均显著高于对照树，‘丽抗’的失绿指数为13.75%，‘燕兴’的失绿指数为46.96%，表明品种‘丽抗’ 和‘燕兴’ 对针叶小爪螨的抗性等级分别为高抗（1级）和感（7级）。

2.2" 次生代谢组轮廓及主成分分析

对‘燕兴’和‘丽抗’的叶片进行代谢组学检测，共得到704个次生代谢物，包括酚酸（217个）、黄酮（245个）、木质素和香豆素（48个）、鞣质（42个）、生物碱（56个）、萜类（72个）、甾体（1个）和其他类（23个）。

在主成分分析中，第1主成分的贡献率为65.58%，第2主成分的贡献率为9.42%，2种主成分贡献率之和为75%，表明2种主成分能够反映‘燕兴’和‘丽抗’的主要特征信息。

2.3" 次生代谢物聚类热图分析

不同样品中代谢物的积累模式差异可以通过聚类热图（图1）进行分析。由图1可知，次生代谢物在不同组间有明显差异，可分为3簇。左侧实线方框内的代谢物在‘燕兴’中含量较高，而在‘丽抗’中含量较低；虚线方框内的代谢物在‘丽抗’中含量较高，在‘燕兴’中含量较低；右侧实线方框内的代谢物在两个品种中均有分布，说明‘燕兴’和‘丽抗’中的次生代谢物种类和含量具有明显差异。此外，不同的生物学重复之间也同样聚成一簇，表明生物学重复之间具有良好同质性和数据的高可靠性。

2.4" 正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）

OPLS-DA分析是一种有监督模式识别的多元统计分析方法，能够剔除与研究无关的影响因子从而筛选差异代谢物。分析结果（图2）可知，R2X=0.746；说明该模型对自变量X的解释程度为74.6%；R2Y=1.000，说明该模型对分类变量Y的解释程度为100%；Q2=0.985，表示该模型对样本变量的预测程度为98.5%，比较组的Q2值高于0.9，说明构建的模型合适可靠且预测程度高。OPLS-DA得分图显示，‘燕兴’和‘丽抗’发生明显分离。

2.5" 差异次生代谢物火山图

以FC值≥2.0或≤0.5，结合OPLS-DA模型中VIP值≥1.0筛选差异代谢物，见图3。在图3中，横坐标绝对值越大，表明该物质在两品种间相对含量差异越大；纵坐标绝对值越大，表明差异越显著，筛选到的代谢物越可靠。共筛选出165个差异代谢物，其中有73个代谢物表达上调，说明有73个代谢物在‘丽抗’中的含量高于‘燕兴’；有92个代谢物表达下调，说明有92个次生代谢物在‘丽抗’中的含量比‘燕兴’中低。165个差异代谢物包括56个酚酸、60个黄酮、19个木质素和香豆素、4个鞣质、5个生物碱、16个萜类和5个其他类。差异代谢物中黄酮和酚酸类占比较高，分别为36%和34%，生物碱、鞣质和其他类占比较低，分别为3%、2%和3%，木质素和香豆素以及萜类分别占12%和10%。

2.6" 差异代谢物KEGG通路分类结果

将筛选出的差异代谢物匹配KEGG数据库从而获得代谢物参与的通路信息。板栗‘燕兴’和‘丽抗’中有33个差异代谢物被注释到12条通路上（图4），包括苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、花青素生物合成（anthocyanin biosynthesis）、类黄酮生物合成（flavonoid biosynthesis）、黄酮和黄酮醇生物合成（flavone and flavonol biosynthesis）等通路。其中注释到代谢通路（metabolic pathways）和次生代谢物合成通路（biosynthesis of" secondary metabolites）的差异代谢物个数较多。

2.7" 差异次生代谢物分析

板栗‘燕兴’和‘丽抗’共筛选出165个差异次生代谢物。仅在‘丽抗’中检测到的代谢物有7个，包括咖啡酰胆、6′-O-反式肉桂酰-8-表金吉苷酸、落叶松脂素-4′-O-葡萄糖苷、阿尔本酚B、地榆素H11、3-羟基-5甲基苯酚-1-O-葡萄糖苷和苜蓿素-7-O-葡萄糖醛酸苷等；仅存在于‘燕兴’中的代谢物有15个，包括4-甲基-5-噻唑乙醇、2，4-二羟基苯甲酸、异嗪皮啶、水杨苷、刺梨酸等。

在‘燕兴’和‘丽抗’中共筛选出60种黄酮类物质存在显著差异，包括查耳酮、二氢黄酮醇、花青素、黄酮、黄酮醇、黄酮碳糖苷、黄烷醇和异黄酮等。其中，‘燕兴’中有30种黄酮类物质含量高于‘丽抗’，差异最大的是3-O-甲基槲皮素，‘燕兴’含量是‘丽抗’的7.33×103倍。在‘丽抗’中有30种黄酮类物质含量高于‘燕兴’，包括槲皮素-3-O-洋槐糖苷、芦丁、山柰酚-3-O-洋槐糖苷、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷等，差异最大的是苜蓿素-7-O-葡萄糖醛酸苷，在‘丽抗’中含量是‘燕兴’的3.44×103倍。两份材料共筛选出包括咖啡酸、阿魏酸等56种酚酸类物质差异表达，其中‘燕兴’中有30种酚酸类物质含量高于‘丽抗’，差异最大的是1-O-对香豆酰奎宁酸，在‘燕兴’中含量是‘丽抗’的1.15×107倍。在‘丽抗’中有26种酚酸类物质含量高于‘燕兴’，差异最大的是3-羟基-5-甲基苯酚-1-O-（6′-没食子酰）葡萄糖苷。

‘燕兴’和‘丽抗’中共有14种木质素和5种香豆素存在显著差异。其中，在‘丽抗’中有8种木质素和1种香豆素含量高于‘燕兴’，‘燕兴’中有10种木质素和香豆素含量高于‘丽抗’，其中包括秦皮乙素、异莨菪亭、去氢二异丁香酚等活性物质。有16种萜类在‘燕兴’和‘丽抗’中存在显著差异，‘丽抗’中有3种萜类物质含量高于‘燕兴’，分别为桃叶珊瑚苷、乙酰梓醇、2α，3α，19α-三羟基熊果酸，‘燕兴’中有13种萜类物质含量高于‘丽抗’。在其他类中，只有物质Solatuberenol A在‘丽抗’中的含量高于‘燕兴’，包括4-甲基-5-噻唑乙醇在内的其余4种物质在‘燕兴’中的含量高于‘丽抗’。

3" 讨" 论

针叶小爪螨发育历期短、为害寄主范围广泛，在我国板栗产区已成为生产上最主要的虫害。如何利用板栗抗螨性进行害螨防治，并培育抗螨新品种，解析板栗次生代谢物构成是第一步。次生代谢物是植物在长期的进化中对生态环境产生适应的结果。由于植物本身不能移动，在进化过程中就不得不依赖次生物质来减轻昆虫或疾病造成的危害，这也是次生代谢物最原始、最主要的生态功能。

本研究在板栗品种‘燕兴’和‘丽抗’中共检测到704个次生代谢物，其中黄酮类和酚酸类包括的次生代谢物数量最多，这两类物质也是筛选出的差异代谢物中占比较高的。前人研究表明，黄酮类物质有助于提高植物的抗逆性。比如，大豆（Glycine max）中异黄酮含量的增加提高了其对大豆花叶病毒的抗性；水稻（Oryza sativa）中的樱黄素对真菌病原体有效，柚皮素对细菌病原体更有效；没食子儿茶素参与类黄酮生物合成及植物防御反应；类黄酮物质积累可以提高水稻抗褐飞虱（Nilaparvata lugens）的能力。本研究也筛选出了樱黄素、表没食子儿茶素等黄酮类差异物质。此外，槲皮素-3-O-洋槐糖苷、芦丁、山柰酚-3-O-洋槐糖苷、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷等这些黄酮醇类物质在高抗螨品种中的含量显著高于感螨品种，推测樱黄素、表没食子儿茶素以及这几种黄酮醇类物质可能参与板栗叶片抵御针叶小爪螨为害，可能是板栗叶片产生抗虫性的生理基础。另外，已有报道证实咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸等酚酸物质参与大豆抵御核盘菌侵染，咖啡酸、肉桂酸、丁香酸对杨树天牛（Xylotrechus rusticus）也有明显的驱避效果。本次研究发现咖啡酸和阿魏酸在‘丽抗’和‘燕兴’中含量具有显著差异，推测其也可能是导致叶片产生抗螨性的生理因子。

此外，还有一些其他类差异代谢物值得关注。4-甲基-5-噻唑乙醇在‘燕兴’中的含量显著高于‘丽抗’，以往研究表明这种物质是一种具有特殊香味的香料，针叶小爪螨可能对这种特殊香味具有偏好而倾向选择此种物质含量更高的感螨品种。因此，不同品种在抗螨性表现出的差异，从次生物质构成方面分析原因，除了抗螨品种可能含有对昆虫具有驱避或拒食功效的某些活性物质外，也有可能是感螨品种具有某种含量更丰富的对昆虫具有引诱作用的物质。

本研究首次解析了板栗叶片中次生代谢物的构成，并比较分析了对针叶小爪螨抗性不同的板栗叶片中差异代谢物的类型，为筛选抗螨活性物质、选育抗螨板栗新品种提供了参考。然而，植物中的初生代谢物和次生代谢物数量庞大，可达20万至100万种。任何单一的平台都不能检测到所有的代谢物信息，因此未来可以利用多个检测平台获取更全面的代谢组学数据，同时结合转录组学挖掘主要代谢途径及关键调控因子，逐步解析板栗对针叶小爪螨抗性差异的遗传基础，为选育抗螨板栗新品种提供依据。

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（责任编辑" 王国栋）