栀子豉汤颗粒对失眠大鼠海马组织中单胺类神经递质和炎性因子的影响

许光亚 周森林 周文月 杨明龙 胡钟姣 时政

收稿日期：2023-04-18

基金项目：成都大学临床医学院/附属医院创新团队项目（CDFYCX202208）；四川省科技厅农业科技成果转化资金项目（2022NZZJ0015）；2020年龙泉驿英才计划C类创新人才计划项目（90）；成都大学附属医院院级课题项目（Y202232、Y202234）

作者简介：许光亚（1982—），男，博士，副教授，从事病理学与病理生理学研究.Email：guangyaxu@foxmail.com

通信作者：时政（1983—），男，博士，教授，从事天然产物活性研究.Email：drshiz1002@hotmail.com

摘要：研究栀子豉汤颗粒对失眠症的作用并探索相关机制.通过建立大鼠失眠模型，以地西泮为阳性对照，研究栀子豉汤颗粒对大鼠神经递质（5HT、DA和NE）与炎性因子（IL1β、IL6和TNFα）含量的影响.将SPF级SD雄性大鼠36只，随机分成6组，分别为对照组、模型组、地西泮组、栀子豉汤颗粒低剂量组、栀子豉汤颗粒中剂量组和栀子豉汤高剂量组，每组6只.造模完成后，分别给予相应浓度药物，对照组和模型组给予同体积的生理盐水，观察各组大鼠的行为学变化及DA、5HT、NE、IL1β、IL6和TNFα水平.旷场实验结果显示，与对照组相比，模型组大鼠的移动距离显著增加（P<0.05），站立次数及粪便颗粒数增加不明显（P>0.05）；与模型组比较，地西泮组和栀子豉汤颗粒高剂量组移动距离和站立次数极显著减少（P<0.01）；各组大鼠的粪便颗粒数无统计学差异（P>0.05）.与对照组相比，模型组大鼠海马组织中的NE、DA、IL6、IL1β和TNFα含量均极显著升高（P<0.01），5HT含量极显著降低（P<0.01）；与模型组对比，地西泮组和栀子豉汤颗粒高剂量组均能极显著降低大鼠海马组织中NE、DA和TNFα含量（P<0.01），显著升高5HT含量（P<0.05）.结果表明，栀子豉汤颗粒可明显改善模型大鼠的失眠病症，其对大鼠脑内5HT、NE、DA、IL6、IL1β和TNFα的调节作用可能是其治疗失眠的作用机制.

关键词：栀子豉汤；失眠；神经递质；炎性因子

中图分类号：R256.23

文献标志码：A

0引言

失眠是指个体对睡眠时间和（或）质量不满意导致非睡眠时间的社会功能受到影响的主观体验.失眠受到不规律的睡眠周期和疾病等多种因素的影响［1］.近年来，科研人员从神经递质紊乱、下丘脑—垂体—肾上腺（HPA）轴功能障碍及褪黑素系统功能下降等方面探讨了失眠发生的机制［2-3］.目前，口服安眠药和心理疗法是临床实践中的主要治疗方法，尽管失眠的症状有了明显改善，但停药后很容易出现耐药性和复发等问题.因此，急需寻求一种安全、有效与不良反应少的治疗方法［4］.

中医认为，人体肝失疏泄且气机郁滞就会出现气机升降，从而很容易受气血生化不足因素的影响而心失所养，导致失眠.故中医以整体视野为指导，进行辨证施治，也是治疗失眠有效的替代疗法之一.中药治疗失眠的作用机制，主要是通过调节中枢神经递质、影响睡眠相关细胞因子及改善中枢神经系统结构等方面发挥作用［5-8］.栀子豉汤最早记载于张仲景所著《伤寒杂病论》，由栀子和淡豆豉2味中药组成，传统医学用其治疗热扰胸膈之不寐［9］.方中栀子清热以除烦，淡豆豉宣散表邪，二药配伍，共奏清宣郁热之功［10］.现代医学研究也证实，栀子豉汤治疗各种类型的失眠疗效确切［11］，然而其治疗失眠的机制不明确.基于此，本研究在前期研究基础上，将栀子豉汤汤剂制备成颗粒，探讨其治疗失眠的作用机制，并进行初步的药效学评价，为栀子豉汤颗粒治疗失眠的临床应用提供依据，并为探索中药治疗失眠的药理机制和治疗方法的改造提供参考.

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器

JD20002型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；XRXZ301型大鼠旷场实验分析系统（上海欣软信息科技有限公司）；Pico17型高速冷冻离心机、MK3型酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；DZBS50型制冰机（江苏白雪电器股份有限公司）；DH4000A型电热恒温培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）.

1.1.2试剂与试药

对氯苯丙氨酸（PCPA），购自Sigma公司；大鼠肿瘤坏死因子α（TNFα）试剂盒、大鼠白细胞介素1β（IL1β）试剂盒、大鼠白细胞介素6（IL6）试剂盒、大鼠5羟色胺（5HT）试剂盒、大鼠多巴胺（DA）试剂盒、大鼠去甲肾上腺素（NE）试剂盒，均购自上海江莱生物科技有限公司；地西泮片，购自山东信谊制药有限公司；0.9%氯化钠注射液，购自四川科伦药业股份有限公司；栀子豉汤颗粒为实验室自制.

1.1.3动物

SPF 级SD雄性大鼠36只，6～8周龄，体质量为（200±20）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK（湘）20190004.在（25±2）℃的环境温度、相对湿度50%±5%和12/12 h的明暗循环中适应1周，期间可自由饮食与摄水.

1.2方法

1.2.1制药

按照3∶2的比例称取栀子和淡豆豉，溶剂用量为8～11倍量水，提取时间为30～84 min，提取次数为2次；浓缩工艺为减压浓缩（温度80 ℃，真空度0.08～0.09 MPa）；干燥工艺为减压干燥（温度80 ℃，真空度0.08～0.09 MPa）；成型工艺为浸膏粉与乳糖质量比为1∶2，85%乙醇为润湿剂，用量为30%，制粒、干燥、整粒，即得［12］.

1.2.2造模与分组

大鼠适应7 d后，随机分成６组，分别为对照组、模型组、地西泮组、栀子豉汤颗粒低剂量组、栀子豉汤颗粒中剂量组和栀子豉汤颗粒高剂量组，每组6只.除对照组外，其余各组大鼠每日上午 8：00～9：00腹腔注射PCPA 450 mg/kg，连续注射3 d.对照组在同等时间下，腹腔注射与PCPA同体积的0.9%氯化钠注射液.当大鼠出现自主活动的站立次数明显增多，昼夜节律失调，睡眠时间显著减少直至完全消失，同时兴奋性和攻击性也明显增强时，表明模型已经成功建立.

1.2.3给药

造模完成后，予以灌胃治疗7 d，大鼠按照与人的等效剂量比6.3进行给药（正常人体质量按60 kg计）［13］.其中，对照组和模型组连续7 d各给予0.9%氯化钠注射液，阳性组给予地西泮1 mg/kg，栀子豉汤颗粒低剂量组给药量为0.93 g/kg，栀子豉汤颗粒中剂量组给药量为1.86 g/kg，栀子豉汤颗粒高剂量组给药量为3.72 g/kg.

1.2.4旷场实验

实验末次给药结束后60 min，将大鼠放置于旷场实验箱正中央适应1 min，并记录每只大鼠在接下来的5 min内的移动距离、站立次数及粪便颗粒数.在2次实验之间，需使用75％乙醇清洗旷场实验箱内壁及底面，以避免上一只大鼠留下的气味对下一次实验造成影响.待实验箱完全晾干后，再进行下一次实验.

1.2.5标本采集及检测

旷场实验结束后，麻醉并断头处死大鼠，取出大鼠大脑，分离得到海马组织.取大鼠海马组织，称重，加入9倍生理盐水匀浆，匀浆液于4 ℃，10 000×g 离心20 min，取上清液，采用相应试剂盒检测海马组织中神经递质5HT、DA和NE，以及炎性因子IL1β、IL6和TNFα含量.

1.3统计学处理

各组计量资料的表现将以均数±标准差的形式进行表示.采用GraphPad Prism６软件进行统计学分析，对多组间样本均数进行比较时，采用单因素方差分析.在此过程中，P<0.05的结果将被视为差异具有统计学意义.

2结果

2.1颗粒制备成功

根据“1.2.1”项下方法制得栀子豉汤颗粒，符合2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）四部通则0104颗粒剂项下的要求，包括性状、粒度、水分和溶解性等方面的要求；根据2020年版《中国药典》一部中各药味项下的薄层色谱鉴别方法及相关参考文献，对栀子豉汤颗粒中的各药材进行定性鉴别，主要包括栀子中的栀子苷和豆豉中的大豆苷元的鉴定，最终成品均检测出对应的指标性物质.

2.2一般状态

在实验过程中，大鼠均未出现死亡的现象.正常大鼠在持续3 d注射PCPA后，明显出现兴奋状态，对声音的活动性和敏感性增加，昼夜节律消失，白天躁动不安，而对照组大鼠昼夜节律正常.经过地西泮和栀子豉汤颗粒干预后，与模型组比较，失眠模型大鼠的睡眠—觉醒节律开始恢复，攻击性逐渐下降，精神状态得到明显改善.表明栀子豉汤颗粒在一定程度上改善了失眠模型大鼠的一般精神状态.

2.3行为学变化

旷场实验的整体数据见表1，具体的数据比较柱状图如图1～图3所示.与对照组比较，模型组的移动距离显著增加（P<0.05），站立次数与粪便颗粒数增加不明显（P>0.05）；与模型组比较，地西泮组和栀子豉汤颗粒高剂量组的移动距离和站立次数均极显著减少（P<0.01）；各组大鼠的粪便颗粒数无统计学差异（P>0.05）.

2.4神经递质含量的比较

不同组别失眠大鼠模型海马区组织中DA、5HT和NE的含量数据见表2，具体的数据比较柱状图如图4～图6所示.与对照组比较，模型组大鼠海马区组织中DA和NE含量极显著升高（P<0.01），而5HT的含量则极显著降低（P<001）；相较于模型组，地西泮组和栀子豉汤颗粒高剂量组大鼠海马区组织内的DA含量极显著降低（P<0.01），栀子豉汤颗粒中剂量组大鼠海马区组织内的DA含量显著降低（P<0.05）；地西泮组和栀子豉汤颗粒高剂量组大鼠海马区组织内的5HT含量显著升高（P<005）；地西泮组、栀子豉汤颗粒中剂量组和栀子豉汤颗粒高剂量组大鼠海马区组织内的NE含量极显著降低（P<0.01）.

2.5炎性因子含量的比较

不同组别失眠大鼠模型海马组织中IL6、IL1β和TNFα含量数据见表3，具体的数据比较柱状图如图7～图9所示.与对照组相比，模型组大鼠海马组织中IL6、IL1β和TNFα含量均极显著升高（P<0.01）；与模型组比较，地西泮组大鼠海马组织内的IL6和TNFα含量极显著降低（P<0.01），IL1β含量显著降低（P<0.05）；栀子豉汤颗粒中剂量组IL6和TNFα含量均显著降低（P<0.05）；栀子豉汤颗粒高剂量组IL6含量显著降低（P<0.05），TNFα含量极显著降低（P<0.01）.

3讨论

栀子豉汤在临床使用过程中存在服用剂量大、周期长、不易携带和储存不适应现代化生活需要等缺点.以上述问题为出发点，本课题组借助现代制药工艺和手段来筛选和优化制备工艺，制备了栀子豉汤颗粒剂，并建立科学的质量控制方法.目前，动物失眠模型建立的方法主要有物理法和化学制剂刺激法等.其中，物理造模法包括强迫运动法、旋转圆筒睡眠剥夺法、水平台环境法和水平转盘睡眠剥夺法等，而化学制剂刺激法是采用腹腔或皮下注射药物，如PCPA和N甲基D天冬氨酸（NMDA）等进行睡眠剥夺［14-15］.PCPA是一种色氨酸羟化酶抑制剂，能够选择性地作用于色氨酸羟化酶，阻碍和耗竭脑内5HT的合成，导致睡眠昼夜节律消失，进而导致失眠［16］.与其他建模方法相比，采用PCPA诱导建模的方法周期短，目标明确，失眠特征显著，适用于失眠症药物的早期筛选，因而被广泛用于建立失眠模型.因此，本研究使用PCPA诱导的失眠症大鼠模型来评估栀子豉汤颗粒对失眠的影响和可能的作用机制.

在失眠模型研究中，公认的观察指标是单胺类神经递质，如DA、5HT和NE等，在一定程度上能够反映失眠症状是否得到改善.研究显示，失眠模型大鼠处于应激状态，兴奋性递质DA的水平会明显升高［17］.5HT是存在于哺乳动物组织中的一种神经递质，特别是在大脑皮层和突触中，增加脑内5HT的含量可以促进睡眠的发生［18-19］.NE是中枢神经系统中主要负责兴奋和觉醒功能的一种神经递质，其与快波睡眠有关，通过调节神经元的活性来影响睡眠—觉醒周期，从而对人体的睡眠状态产生影响［20］.在实验中发现，大鼠注射PCPA后，海马组织中DA和NE含量明显升高，5HT含量明显下降，给予药物治疗后能逆转上述指标.

IL1β、IL6和TNFα是与睡眠调节相关的关键炎性因子，能够参与中枢神经系统生理睡眠的调节［21-22］.有研究者对栀子豉汤治疗失眠的成分使用网络药理学的方法进行了预测，预测结果表明，栀子苷和染料木素等活性成分是栀子豉汤发挥治疗作用的关键，这些活性成分作用于IL6、TNF、IL1β和ESR1等核心靶标，然后通过神经活性配体和受体相互作用、MAPK信号通路及TNF因子信号通路等多条通路对失眠进行治疗［23］，故将这些炎性因子作为栀子豉汤颗粒治疗失眠模型大鼠的评价指标.可以看出，高剂量和中剂量的栀子豉汤颗粒均能降低失眠模型大鼠海马组织中IL1β、IL6和TNFα的水平，验证了网络药理学部分结果.

栀子豉汤颗粒可明显改善失眠模型大鼠的一般状态，本研究结果也表明栀子豉汤颗粒对大鼠脑内5HT、NE、DA、IL6、IL1β和TNFα的调节作用可能是其治疗失眠的作用机制，同时通过对比地西泮组和栀子豉汤颗粒组大鼠的神经递质和炎性因子的变化，发现栀子豉汤颗粒对各类神经递质和炎性因子的影响与地西泮的作用相当甚至更强，这也表明栀子豉汤颗粒拥有足够的利用价值，也为栀子豉汤颗粒的进一步开发研究提供理论依据.

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（责任编辑：伍利华）