单细胞RNA测序及其在肺癌诊疗中的应用进展*

全 念 综述,陈 奎,郭铭静,张立群 审校

陆军军医大学第二附属医院检验科,重庆 400037

肺癌是最常见的癌症之一,也是癌症相关死亡的主要原因,每年约有200万新发病例和176万死亡病例[1]。据我国国家癌症中心统计,2016年我国肺癌发病率和死亡率均居恶性肿瘤首位,其中新发病例约82.8万,死亡病例约65.7万[2]。肺癌的5年生存率仅为22.9%,部分原因是大多数患者在初诊时已发展为晚期肺癌[3]。因此,早诊断、早治疗是降低原发性肺癌患者死亡率的有效措施[4]。肺癌是一种具有广泛临床病理特征的异质性疾病,目前对其了解尚不足[1,5]。低剂量计算机体层成像(LDCT)对早期发现小结节具有较高敏感性,可将死亡率降低20%;然而,LDCT的使用仍然受到高假阳性率、辐射暴露和高成本的限制[6]。临床诊断需要组织活检以确定肿瘤组织学和分期,然而收集组织活检的操作具有一定的局限性和风险[4]。

单细胞RNA测序(scRNA-seq)自2009年首次报道以来,以单细胞分辨率分析转录组数据,scRNA-seq正在成为人类癌症研究中使用的有力工具[7-8]。该技术提供单个肿瘤细胞的生物学信息,分析肿瘤内表达异质性的决定因素,并确定肿瘤疾病形成的分子基础[9]。本文从scRNA-seq技术的应用现状、肺癌异质性、肿瘤微环境、生物标志物、治疗和耐药性等方面综述其在肺癌诊疗中的应用进展,并提出scRNA-seq技术的主要发展方向。

1 scRNA-seq技术概述

scRNA-seq主要包括单细胞分离、裂解、逆转录、cDNA扩增、文库制备、测序和数据分析等7个步骤[10]。单细胞分离是scRNA-seq的限制步骤,文库制备也是提高scRNA-seq研究通量的关键因素[11]。可用于分离单个细胞的方法包括梯度稀释、毛细管移液、激光捕获显微切割、微流控分离、荧光激活细胞分选、磁性激活细胞分选[12],其中微流控分离平台因其高通量和低成本而成为主流方法[13]。

一般来说,scRNA-seq分析方案可分为全长转录本测序方法和3′/5′末端转录本测序方法[14]。全长转录本测序方法有Quartz-Seq、Smart-Seq和Smart-Seq2等,3′/5′末端转录本测序方法有STRT-Seq、CEL-Seq、MARS-Seq、Drop-Seq和InDrop等[12]。基于微流控和Drop-Seq的商用平台10×Genomics Chromium是使用最广泛的平台,具有高灵敏度和低技术噪声等优势[15]。

2 scRNA-seq在肺癌中诊疗的应用

scRNA-seq技术可以从肿瘤异质性、肿瘤微环境、细胞发育分化和细胞通讯等生物学方面对肺癌进行更深入地研究和理解,从而辅助肺癌诊断、肺癌发生、发展及转移、肺癌耐药和治疗及肺癌监测和预后。然而,scRNA-seq预先把组织分解成单细胞悬液,会破坏组织的空间结构,从而丢失了空间和组织信息。为了弥补此缺陷,基于scRNA-seq的空间转录组测序(SRT)应运而生,并且SRT被《Nature Methods》评为2020年年度技术[16]。本部分拟从肺癌异质性、肿瘤微环境、肺癌监测,以及肺癌耐药和治疗等方面综述其重要进展。

2.1scRNA-seq与肺癌异质性 肿瘤异质性是恶性肿瘤的关键特征,也是癌症治疗和研究的重大障碍[17]。因此,迫切需要开发新方法,以精确检测肿瘤异质性的分子机制。MA等[18]分析了来自肺腺癌(LUAD)患者和细胞系的scRNA-seq数据,以表征免疫反应相关基因的肿瘤内异质性,并证明了它们对免疫治疗疗效的潜在影响。干扰素γ(IFN-γ)信号通路基因与单个癌细胞中的其他基因(如MHCⅡ)异质表达和共调控。细胞系中IFN-γ信号通路中基因的下调对应于获得性抗性表型。此外,对两组肿瘤限制性抗原的分析揭示了它们在单细胞中表达的异质性。HE等[19]对来自7个携带EGFR突变的Ⅰ/Ⅱ期LUAD样品和5个肿瘤邻近肺组织的共125 674个细胞进行了scRNA-seq;通过拟时序分析发现,ELF3是晚期肿瘤细胞中上调最多的基因之一,提示ELF3可能是LUAD未来药物发现的治疗靶点。TIAN等[20]对来自11例小细胞肺癌(SCLC)患者原发肿瘤和匹配正常邻近组织(NATs)的约5 000个细胞进行了高精度单细胞转录组学分析,揭示了SCLC中关键转录因子的肿瘤内异质性,以及相关的基因表达模式和功能。非神经内分泌肿瘤与SCLC炎症基因特征和免疫细胞浸润增加相关。ZHANG等[21]建立了一个多组学图谱,整合了来自多个LUAD和肺鳞癌(LUSC)患者的52个scRNA-seq和2 342个公共传统RNA测序数据。LUAD和LUSC含有在肺泡Ⅱ型细胞(AT2)和基底细胞的亚簇中选择性地扩增,高百分比的成纤维细胞和AT2导致LUAD和LUSC的存活率低,这表明细胞组合在预测肺癌预后不良方面的潜在作用,包括亚群标记AQP5和KPNA2在内的10个基因的过表达进一步表明了其功能及作用,为肺癌的早期诊断和治疗提供了潜在的靶点。

2.2scRNA-seq与肿瘤微环境 TME由成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞等基质细胞组成,在肿瘤的发生、进展和转移中起着至关重要的作用[19,22]。LAVIN等[23]通过多重组织成像,以及肿瘤、非受累肺和血液的配对单细胞分析18例LUAD患者,发现Ⅰ期肺腺癌病变已经有明显改变的T细胞和NK细胞区室。为确定LUAD中临床相关的微环境和癌症特征,BISCHOFF等[24]将scRNA-seq应用于10个LUAD组织和10个正常对照组织,该研究揭示了反映组织学分级和致癌途径活性的异质癌细胞转录组,以及两种不同的微环境模式:CP2E模式和N3MC模式。免疫激活的CP2E微环境由癌症相关肌成纤维细胞、促炎单核细胞来源的巨噬细胞、浆细胞样树突状细胞和耗竭的CD8+T细胞组成,预后不佳。相比之下,惰性N3MC微环境的特征是正常样肌成纤维细胞、非炎症性单核细胞来源的巨噬细胞、NK细胞、髓样树突状细胞和常规T细胞,并且预后良好。为阐明非小细胞肺癌(NSCLC)中肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的亚群组成和功能异质性,YANG等[25]利用scRNA-seq技术结合ssGSEA分析、拟时序分析和场景分析对早期吸烟NSCLC患者进行了分析,在NSCLC患者的TME中发现了2种普遍存在的免疫抑制性TAM:CCL18+巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞。CCL18+巨噬细胞通过抑制炎症因子的产生发挥免疫抑制作用,并表现出高水平的脂肪酸氧化磷酸化代谢。相反,SPP1+巨噬细胞的主要代谢途径是糖酵解,糖酵解通过促进血管生成和基质重塑促进肿瘤转移。WANG等[26]对40个肿瘤样品和19例NSCLC患者的匹配的邻近正常组织的72 475个免疫细胞进行了scRNA-seq,并绘制了系统的免疫细胞转录组图谱。基于TCGA对不同的细胞组成、差异表达基因(DEG)、细胞-细胞相互作用、拟时序轨迹、转录因子和预后因子进行联合分析,揭示了细胞毒性和效应性T细胞、NK细胞,以及不同的功能性巨噬细胞(Mφ)亚型在LUAD和LUSC之间免疫微环境异质性中的中心作用。Mφ的优势亚型在LUAD为FABP4-Mφ,在LUSC为SPP1-Mφ。LAMBRECHTS等[27]对5例NSCLC患者的84 341个基质细胞进行了scRNA-seq,并鉴定了52种基质细胞亚型,包括不同类型的肿瘤相关成纤维细胞、内皮细胞和迄今为止被认为是同质的肿瘤浸润免疫细胞。CLARKE等[28]对肺癌患者肿瘤和正常肺组织中的组织驻留记忆T细胞(TRM)和非TRM细胞进行了单细胞和传统转录组分析,与表达PD-1的非TRM细胞相比,肿瘤中表达PD-1的TRM细胞被克隆扩增和富集,用于与细胞增殖和细胞毒性相关的转录本。这一特征在共表达PD-1和TIM-3的TRM细胞亚群中更为突出,该PD-1+TIM-3+TRM细胞亚群在PD-1抑制剂应答者和细胞毒性T细胞反应幅度更大的肿瘤中富集。为了在NSCLC患者中绘制由单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞组成的TIM,ZILIONIS等[29]的研究应用scRNA-seq发现了25种TIM亚群,其中大多数在患者中同时表达,在比较人类和小鼠之间的TIM时,发现树突状细胞和单核细胞之间亚群结构的近乎完全一致,中性粒细胞亚群偏保守,以及巨噬细胞具有物种差异。

LU等[30]使用scRNA-seq分析了肺磨玻璃结节腺癌(GGN-ADC)和实体腺癌(SADC)各5例患者的60 459个细胞。GGN-ADC癌细胞中与细胞增殖相关的信号通路下调,基质细胞在GGN-ADC和SADC中具有不同的影响。在GGN-ADC中,血管生成的信号通路下调,成纤维细胞低表达胶原蛋白,免疫细胞更加活跃。与SADC相比,癌细胞和TME共同促进了GGN-ADC的生长。XING等[31]对16个亚实体结节(SSN)样本、6个相邻的正常肺组织(nLung)和9个伴有淋巴结转移的原发性LUAD(mLUAD)样本进行了scRNA-seq分析。细胞毒性NK T细胞在SSN的TME中占主导地位,SSN中的恶性细胞经历强烈的代谢重编程和免疫应激。在SSN中,内皮细胞的亚群组成与mLUAD相似,而成纤维细胞的亚型分布更像nLung,表明内皮细胞在肿瘤发生的早期起着关键作用。LIU等[32]分析来自4个纯毛玻璃结节(GGN)、4个实性结节(SN)和4个正常组织的76 762个细胞的单细胞转录组谱,发现NK和CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫随着LUAD的进展而逐渐减弱, B细胞介导的体液免疫在SN中更活跃。在从GGN到SN的进展过程中,一些特殊上皮细胞的增殖能力增加。此外,基质细胞和M2巨噬细胞可以帮助LUAD的进展。

2.3scRNA-seq与肺癌监测 大约60%的肺癌患者在最初诊断时具有远处转移,这是肺癌高病死率的主要原因[4]。所以,肺癌的早期诊断对治疗至关重要。KIM等[33]用scRNA-seq对34例早期LUAD患者分析原发性肺肿瘤和正常肺组织中CXCL1、CXCL2和CXCR2的mRNA,以及相关的表观遗传调节因子miR-532-5p、miR-1266-3p和miR-3163进行了定量检测,最终发现趋化因子mRNA与miR-532-5p和miR-1266-3p在早期原发性LUAD中呈负相关,特别需要指出的是,miR-532-5p可在相应LUAD的血浆中定量;该研究证实了趋化因子基因mRNA和相应microRNA的数量差异可用作表征肺癌的分子标记。KIM等[34]对44例患者的208 506个正常组织或早期至转移期癌症细胞进行了scRNA-seq,确定了一种偏离正常分化轨迹并主导LUAD进展和转移期的癌细胞tS2亚型,TCGA数据库分析证实tS2标记基因表达高表达的患者总体存活率较差。肿瘤、基质细胞和免疫细胞之间活跃的细胞群动力学和分子相互作用提供了促肿瘤和免疫抑制的微环境。TME中的mo-Mac亚群具有免疫激活和调节的双重功能,向T细胞提供刺激和抑制信号,所以可以靶向mo-Mac,以重新定向免疫激活。ZHANG等[35]对2例肺腺癌PDX病例的原发和脑转移肿瘤组织中分离的肿瘤细胞进行基因差异表达分析(GSE69405),通过维恩图鉴定了肺腺癌脑转移的4个关键基因,包括CKAP4、SERPINA1、SDC2和GNG11。

JIN等[36]利用LUAD的scRNA-seq数据构建了5个基因(IDH2、ADRB2、SFTPC、CCDC69和CCND2)预后风险模型,风险评分与肿瘤浸润免疫细胞和肿瘤基因组异常之间存在相关性,具有较高风险评分的患者具有明显较低的免疫治疗应答率。XU等[37]利用LUAD单细胞数据集GSE149655构建了基于10个基因(CCL20、CP、HLA-DRB5、RHOV、CYP4B1、BASP1、ACSL4、GNG7、CCDC50和SPATS2)的预后风险模型,评分越高预后越差。其中,HLA-DRB5表达与LUAD风险呈负相关,CCDC50表达与LUAD风险呈正相关。

2.4scRNA-seq与肺癌耐药和治疗 靶向癌症治疗的最大障碍是耐药性的必然出现[38]。所以,对肺癌耐药机制应进行更深入的研究。MAYNARD等[5]对30例使用靶向治疗前和靶向治疗期间转移性肺癌患者的49个活检样本进行scRNA-seq,阐明了单个肿瘤样品中丰富的突变和转录多样性,以及治疗期间癌细胞转录谱和TME组成的动态变化,揭示了纤溶酶原激活级联反应在较差临床结果和靶向治疗耐药性的临床相关性和潜在作用。残余疾病(RD)治疗后存活的癌细胞表达了肺泡再生细胞特征,表明治疗诱导了原始细胞状态转变,而治疗中进行性疾病(PD)的癌细胞上调了尿蛋白、纤溶酶原和缝隙连接通路。RD和免疫抑制细胞状态下存在活性T淋巴细胞和减少的巨噬细胞,以PD为特征,证明癌症和肿瘤微环境细胞表现出显著的治疗诱导的可塑性。ZHONG等[39]对Pembrolizumab治疗前后肺癌患者的外周血单个核细胞进行scRNA-seq,泛素介导的蛋白水解、细胞周期、自然杀伤细胞介导的细胞毒性被鉴定为NKG7+NK T细胞中的PD-1阻断反应途径,凋亡Th1和Th2细胞分化被认为是Pembrolizumab影响NK T细胞的途径。在基因水平上,在TCGA数据集验证后,ID2、PIK3CD、UQCR10、MATK、MZB1、IL7R和TRGC2与PD-1表达呈显著相关性,这可作为PD-L1阴性LUSC患者的预测标志物,这些患者可受益于Pembrolizumab。HE等[22]分析了LUAD3个代表性单细胞RNA-seq数据集中昼夜节律破坏(CRD)在肿瘤中作用,结果显示高CRD评分与LUAD患者的不良预后,以及包括化疗和酪氨酸激酶抑制剂治疗在内的抗癌治疗的耐药性显著相关,其机制是CRD参与了恶性细胞作为持续细胞的转化,从而导致耐药性。对这些机制的更好理解可能会为将“基于生物钟的抗癌方法”纳入精准医学的治疗方案提供新的可能性。

3 总结与展望

scRNA-seq技术以其高分辨率的特点为肺癌研究提供了新的研究手段,对肺癌的异质性、肿瘤微环境、早期诊断、侵袭和转移及治疗和耐药等方面进行了探索,提升了对肺癌的认识。此外,scRNA-seq与基因组、表观遗传组、蛋白组、代谢组、空间转录组学技术联合分析可以对肺癌组织进行更加深入和立体地分析,可以提供更加全面、完整的数据,加深肿瘤学家对肺癌发生、发展、治疗等的认识,为精准化和个体化治疗提供更为准确地指导。当然,scRNA-seq技术在降低成本、优化检测过程,提升易用性和可及性,优化单细胞悬液的制备,提高扩增时覆盖率、降低错配率和减少噪音率,提高细胞捕获效率和测序深度,优化生物信息学算法等方面仍有改进空间。

总之,在促进scRNA-seq技术进步的同时,把其与其他组学或生物学技术相结合将进一步推进肺癌的研究及治疗。