m6A及m5C甲基化修饰通过促进细胞增殖与转移影响癌症的发生和发展

邵爽 郭纪伟 孟玮

滨州医学院附属医院医学研究中心，滨州 256600

RNA 甲基化修饰是一种广泛存在于各类RNA 中的修饰作用，其主要作用是通过调节mRNA 的转录、出核、稳定性和翻译效率，从而控制靶蛋白的表达［1］，其中研究最热门的是N6-甲基腺苷（m6A）及5-甲基胞嘧啶（m5C）的修饰作用，它们可以直接作用于信号通路中的关键分子导致其表达上调或下调，也可以通过作用和改变与该通路相关的其他蛋白的表达水平间接调控该信号通路的活性。已有研究表明，甲基化修饰与多种人类疾病有关，影响不同类型癌症的生长和转移［2］。信号通路之间存在多种相互作用，m6A和m5C 修饰通过调控单个因子的表达进而在多种致癌通路中发挥关键作用。本综述着重探讨RNA 甲基化修饰中比较热门的m6A 及最近兴起的m5C 修饰对信号通路中关键分子的调控从而影响癌症发生发展的分子机制。

RNA甲基化修饰

RNA甲基化修饰是将甲基从一个活性甲基化合物转移到另一个化合物，根据甲基化的不同部位，RNA甲基化包括m6A、m5C、N7-甲基鸟嘌呤核苷酸（m7G）、N1-甲基腺嘌呤（m1A）等［3-4］。RNA 甲基化修饰是一个可逆的动态过程，由甲基转移酶、去甲基酶及甲基化结合蛋白等多种酶参与并介导RNA 甲基化修饰［5］，下面着重介绍比较热门的m6A 及最近兴起的m5C修饰。

1.m6A甲基化修饰及其调节因子

m6A 是以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，将甲基转移到腺嘌呤核苷酸的第六个N 原子上［6］。m6A 甲基化修饰是真核生物mRNA 中最丰富的甲基化修饰，富集在终止密码子、RNA 外显子区域和3′非翻译区（3′UTR）中的RRACH（R=A 或G，H=A，C 或U）序列中［7-8］。m6A 有3 种类型的调节因子：其一是甲基转移酶，研究较多的是甲基转移酶3（METTL3），它含有SAM 结合位点，而METTL3 与METTL14 以1∶1 的含量形成异源二聚体，Wilms 瘤1-相关蛋白在甲基化酶复合物中充当支架，共同形成甲基转移酶复合体，将甲基从SAM 转移到受体腺嘌呤上［9］；其二是去甲基化酶，它使RNA 甲基化修饰动态可逆成为可能，是RNA去甲基化过程中的调节蛋白，其中研究较多的是肥胖相关蛋白（FTO）和alkB 同源蛋白5（ALKBH5），FTO C-端的茎环结构域和ALKBH5 N-端的卷曲螺旋结构域通过与甲基化的RNA 底物相互作用而行使去甲基化活性［10-11］，进而影响mRNA 的核输出和RNA 的代谢［12-13］；其三是甲基化结合蛋白，它与甲基化的RNA 结合并发挥相应的功能。其中研究较多的是同源域（YTH）结构域家族，即含有YTH 结构域的蛋白YTHDF1/2/3和YTHDC1/2，其中YTHDC1分布在细胞核中，而YTHDF1/2/3 和YTHDC2 则主要分布在细胞质中。YTHDF1可识别终止密码子周围的m6A修饰，促进mRNA翻译，而YTHDF2识别不进行翻译的mRNA，加速其降解［14-15］。

2.m5C甲基化修饰及其调节因子

m5C 是另一种丰富的RNA 甲基化修饰类型，由m5C 甲基转移酶催化，将甲基从SAM 上转移到RNA 序列中胞嘧啶碱基的第五个C 原子上。m5C 修饰广泛分布于各种RNA中，包括mRNA、rRNA、tRNA、ncRNA、vault RNA 等，从而参与mRNA的核输出、RNA的稳定性和翻译［16］。m5C也有3种类型的调节因子：m5C 甲基化酶包括NOL1/NOP2/SUN 结构域（NSUNs）蛋白质家族和DNA甲基转移酶（DNMTs）家族成员，其中NSUN2 是一种核仁RNA 甲基转移酶，且是催化m5C 形成最主要的RNA 甲基转移酶［17］。NSUN2 在细胞分化、增殖、迁移以及调控肿瘤发生和发展等多种生物学功能中起着非常重要的作用［18］；m5C 去甲基化酶包括TET 家族（TET1-3）和ALKBH1，TET 家族催化去甲基化从而生成5-羟甲基胞嘧啶（hm5C），ALKBH1主要参与tRNA 的去甲基化修饰生成hm5C 后再进一步氧化生成5-胞嘧啶甲酰（f5C）［19］；m5C 甲基化结合蛋白主要包括Aly/REF 输出因子（ALYREF）和Y-盒结合蛋白-1（YBX1）。ALYREF 是TREX复合物的关键组分之一，它结合的mRNA 位点大多位于紧靠翻译起始位点附近富含CG 碱基的结构域，并通过K171位的赖氨酸识别mRNA上的m5C所修饰的位点并促进其出核。YBX1 则通过其CDS 的W65 位吲哚环识别m5C 修饰的mRNA来维持其稳定性，进而影响靶基因的表达［20］。

与m6A、m5C相关的热门致癌信号通路

1.哺乳动物不育系20 样激酶（MST）-Yes 关联蛋白（YAP）通路

哺乳动物中的MST-YAP信号通路最初是在黑腹果蝇中发现的，该通路在进化上高度保守，其核心反应是一个激酶级联反应，可调节细胞的增殖和分化，参与器官再生和组织修复等，因此其功能一旦失调将导致癌症的发生和发展［21］。其中Ste20-like 激酶1/2 与它们的辅助因子Salvador 同源物1结合，磷酸化并激活大肿瘤抑制激酶1/2（LATS1/2），LATS1/2 与其辅助因子MOB 激酶激活因子1A 和1B 使YAP/含PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）磷酸化并失活，使其驻留在细胞质中并降解，可抑制其核转位从而失去辅转录因子的活性［22］。当YAP/TAZ 未被磷酸化，它们则会进入细胞核并与TEA 结构域转录因子家族转录因子结合，进而调控下游靶基因的表达。因此，MST-YAP 信号通路通过调节YAP的磷酸化及核定位，进而影响整个信号通路的活性，从而调控细胞的生物学功能。在过去的十年中，由于该通路在发育、再生和癌症中发挥了关键的调控作用，这一领域得到了广泛的研究。在癌症中，已经表明YAP/TAZ 在肿瘤中的表达异常，促进了肿瘤的发生和发展，被认为是人类实体癌的癌基因，因此MST-YAP 信号通路途径可能成为癌症治疗的新靶点［23］。

2.磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-PKB/蛋白激酶B（Akt）通路

PI3K-Akt 通路在细胞代谢、生长、增殖、凋亡和血管生成等基本细胞活动和癌症的发生及发展中起着至关重要的作用［24］。PI3K具有磷脂酰肌醇激酶活性和丝氨酸/苏氨酸激酶的活性，其根据不同结构和底物可以分为三类，即Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类。其中研究最广泛的是Ⅰ类，是由催化亚基P110 和调节亚基P85 共同组成的异源二聚体，在肿瘤的发展过程中发挥重要作用［25］。Akt具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，其作为PI3K-Akt 通路的核心分子可以通过抑制叉头状转录因子O 及糖原合成酶激酶3（GSK3）-谷氨酰胺合成酶活性分别调控细胞的凋亡及影响糖原的合成，还可通过激活ATP柠檬酸裂解酶及内皮型一氧化氮合酶分别促进脂肪酸的合成及维持血管的功能。但Akt 的过度激活导致癌症的产生，如逃避凋亡、过度生长、侵袭和转移［26］。当细胞中的配体和受体结合，激活细胞内的PI3K，接下来PI3K 促使磷脂酰肌醇4，5二磷酸磷酸化转变为3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），PIP3 进入细胞后增强Akt 的磷酸化，使Akt 部分或完全激活，从而进入细胞核，调控下游靶基因的表达。作为PIP3 活性的抑制基因（同源性磷酸酶-张力蛋白、蛋白磷酸酶2A、亮氨酸丰富重复蛋白质磷酸酶蛋白），当其表达水平升高时，PI3P 去磷酸化通过抑制PI3K/Akt 信号通路传导进而抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡［27］。

3.Wnt/β-catenin信号通路

经典的Wnt 信号通路是一个复杂的信号通路，其决定生物体内多种细胞命运并调控细胞的增殖和分化等重要生物学过程。此途径主要包括四个片段：胞外信号、膜段、胞质段和核段。胞外信号指Wnt 配体蛋白，细胞膜段主要包含Wnt 受体卷曲蛋白（FZD）和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（LRP5/6），细胞质部分主要包括β-连环蛋白（β-catenin）、蓬乱蛋白和破坏复合物（DC），该DC 由轴蛋白（Axin）、酪蛋白激酶1α、腺瘤性结肠息肉病蛋白和GSK-3β组成，核段主要包括转位到细胞核的β-catenin、T 细胞特异性因子（TCF）/淋巴增强子结合蛋白家族成员以及β-catenin下游靶基因等［28］。在Wnt 配体缺失的情况下，β-catenin 与DC 结合，结合后的β-catenin 被磷酸化进而被降解［29］。经典的Wnt 信号通路核心作用方式与β-catenin 的稳定性密切相关，当β-catenin 水平低下时，Wnt 信号通路被抑制；β-catenin 水平较高时，Wnt 信号通路被激活。Wnt 信号通路激活时，促进细胞的异常增生分化，从而导致肿瘤的进展［30］。当Wnt 配体与膜上的FZD 及LRP5/6 受体结合时，Axin-GSK3β 蛋白复合物也被募集到细胞膜，Axin不再发挥作用，β-catenin在细胞胞质内逐渐累积从而进入细胞核，将Groucho 蛋白替换，并与TCF 结合调控下游靶基因的表达［31］。

4.丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路

MAPK 信号通路是一系列高度保守的酶促级联反应，参与细胞的生存、增殖、凋亡、分化和癌症在内的多种生物学活动。信号通路包括3种主要的激酶，即MAPK激酶的激酶、MAPK 激酶和MAPK，它们依次被磷酸化后激活并调控下游靶分子的磷酸化［32］。MAPK通路有4条经典的分支，分别是细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2、c-Jun 氨基末端激酶、细胞外信号调节激酶5 和p38 MAPK。其中ERK/MAPK 信号通路是研究最详尽的MAPK 信号通路，与细胞增殖和分化密切相关并在细胞信号转导网络中起着重要作用［33］。当细胞外配体与质膜上的特定细胞表面受体结合时，该信号通路被激活，产生生长因子受体结合蛋白2（GRB2）的结合位点，招募SOS 蛋白到膜上并与之结合，SOS 将GDP 结合的肾素-血管紧张素系统（Ras）活化为Ras 相关GTP 酶（Ras-GTP）。Ras-GTP能将苏氨酸蛋白激酶（Raf）蛋白招募到细胞膜上并在一系列复杂的过程中被活化，活化的Raf激酶接着与下游的丝裂原活化的细胞外信号调节激酶（MEK）1/2 结合并使其磷酸化，导致下游信号传导的ERK1/2 被磷酸化，活化的ERK1/2将继续磷酸化髓细胞组织增生原癌基因、特异性蛋白 1、转录激活因子ETS样蛋白1和E26转录因子等，进而调控与细胞增殖及细胞周期有关的基因表达［34］。在MAPK信号通路中，Ras、Raf、MEK1/2和ERK1/2中的任何一个因子功能异常都会导致严重的肿瘤疾病。

m6A及m5C修饰通过影响与细胞增殖和转移有关的信号通路调控癌症发生和发展

根据国家癌症中心最新数据显示，中国当前主要恶性肿瘤中死亡率前5 包括肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、食管癌［35］。以下着重介绍m6A 及m5C 修饰通过影响与细胞增殖和转移有关的信号通路调控上述癌症发生和发展。

1.肺癌

在Hippo-YAP 信号通路中，去甲基化酶ALKBH5 通过减少YAP m6A 甲基化修饰来抑制非小细胞肺癌（NSCLC）的增殖、侵袭和转移，通过YTHDF2识别并促进YAP mRNA 降解及抑制微小RNA-107/大肿瘤抑制激酶2 介导的YAP 活性来抑制肿瘤的生长和转移［36］。m6A 甲基化酶METTL3 通过与真核生物翻译起始因子3H相互作用促进Hippo通路效应因子TAZ 的翻译，从而增加肺腺癌（LUAD）细胞的生长、生存和侵袭能力［37］。在m5C 甲基化酶NSUN2和m5C 甲基化结合蛋白ALYREF 的促进下，YAP 3′UTR 被m5C 修饰，这种修饰增加了YAP mRNA 的稳定性，并抑制了附近的m6A 修饰和miR-582-3p结合，进而促进LUAD的发生发展［38］。

2.肝癌

在肝母细胞瘤（HB）中，微小RNA-186（miR-186）可直接结合m6A甲基化酶METTL3 mRNA的3′UTR降低其表达，miR-186/METTL3 轴可以调控Wnt/β-catenin 信号通路，miR-186 的表达下调导致METTL3 过表达促进HB 细胞增殖、迁移和侵袭。在HB细胞中发现METTL3和编码β-连环蛋白的钙黏蛋白相关蛋白（CTNNB1）基因存在显著正相关，METTL3 可以通过增加Wnt/β-catenin 通路中CTNNB1 基因的m6A 水平，YTHDF2 识别CTNNB1 中5′UTR m6A 修饰，从而促进HB 细胞的增殖、迁移、侵袭以及术后复发［39-40］。在肝细胞癌（HCC）中，含有RAD52基序的蛋白 1（RDM1）具有肿瘤抑制因子的功能，RDM1 在p53 存在下抑制Ras/Raf/ERK 信号转导。m6A 甲基化酶METTL3 使RDM1 mRNA 的m6A 甲基化修饰增加并抑制其表达，从而促进HCC 的发展［41］。 m6A 甲基化结合蛋白YTHDF1 可通过影响AKT2 和AKT3 的翻译进而影响PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路，促进HCC 细胞的迁移，也可以诱导上皮间质转化促进HCC细胞的侵袭［42］。

3.胃癌

m6A修饰在胃癌中起到抑制肿瘤的作用，即过表达m6A甲基化酶METTL14 或者敲低m6A 去甲基化酶FTO 会通过抑制Wnt 和PI3K-Akt 信号传导进而抑制胃癌细胞增殖及侵袭［43］。m6A 甲基化结合蛋白YTHDF1 可以通过增强FZD7 的翻译，使Wnt/β-catenin 通路过度激活促进胃癌发生，YTHDF1 与胃癌的发生和进展呈正相关，m6A 依赖性YTHDF1-FZD1-β-catenin 轴在胃癌发展中起着至关重要的作用［44］。胃癌中同源盒蛋白B13（HOXB13）和FTO 的表达升高，FTO 可抑制下游靶基因HOXB13 的甲基化，通过激活PI3K/AKT/mTOR 信号通路，促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭［45］。m6A 甲基化酶METTL3 在胃癌中的过表达增加了肿瘤抑制基因素金属蛋白酶9（ADAMTS9）的m6A 修饰，使ADAMTS9 的表达降低通过调节PI3K/AKT/mTOR 通路促进胃癌中的血管生成和癌变［46］。

4.结直肠癌

m6A 甲基化结合蛋白YTHDF1 通过增强FZD9 和Wnt6 翻译效率，导致Wnt/β-catenin 信号通路过度激活，促进结直肠癌的发生，YTHDF1 与结直肠癌的发生和进展呈正相关［47］。m6A 甲基化酶METTL3 在结直肠癌调控中具有双重作用，降低METTL3 通过调节p38/ERK 通路促进结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭［48］。然而过表达METTL3 也可以促进结直肠癌转移，METTL3 介导miR-1246 甲基化修饰抑制抗癌基因SPRED2 的表达进一步使Raf/MEK/ERK 通路失活，促进癌细胞迁移和侵袭，METTL3/miR-1246/SPRED2轴在肿瘤转移中起重要作用［49］。

5.食管癌

有研究发现，m5C 甲基化酶NSUN2 介导的m5C 甲基化修饰通过调控PI3K/AKT 和ERK/MAPK 通路中的GRB2 从而促进食管鳞状细胞癌（ESCC）的发生和进展；其作用机制为E2F1转录因子上调NSUN2的表达进而增加GRB2的m5C甲基化水平，m5C甲基化结合蛋白内膜组织Lin-28同系物B与带有m5C修饰的GRB2结合进而增加GRB2的稳定性，GRB2水平增加激活PI3K/AKT 和ERK/MAPK 信号通路，促进ESCC进程［50］。

展 望

综上所述，本文阐述了部分m6A 甲基化修饰通过影响与细胞增殖和转移有关的信号通路调控癌症的发生发展。目前，在开发m6A 靶向治疗方面的研究主要集中在m6A 修饰酶的靶向性，以m6A 为靶点的治疗已逐渐被应用于肿瘤等疾病的临床治疗中。最近，m5C 甲基化在肿瘤方面的研究引起了越来越多关注但相关通路与m5C 修饰之间的关系目前报道相对较少［51］。m5C 与m6A 修饰的研究思路基本相同，而相比m6A，m5C的一些甲基转移酶、去甲基酶和甲基化结合蛋白等组分鉴定出的种类较少，因此RNA 甲基化修饰目前还具备非常大的潜在研究价值。

作者贡献声明邵爽：起草文章；郭纪伟：对文章的知识性内容作批评性审阅；孟玮：支持性贡献