仙客来枯萎病病原菌产孢培养基筛选及培养条件优化

宋卓琴 贾民隆 梁峥 梁晓霞 屈璐 王玉川 段九菊 曹冬梅

摘要 为了获得高浓度的仙客来枯萎病病原菌的孢子悬液，通过对不同营养培养基进行初筛，再以初筛营养成分进行正交试验，得到最佳营养配比，进一步通过单因素试验对培养基的pH和培养温度进行筛选。结果表明，马铃薯、绿豆、蔗糖为仙客来枯萎病病原菌产孢培养基的最佳营养成分，最佳配比为绿豆5.0%、蔗糖0.5%、马铃薯20%，培养基最佳pH为6，最佳培养温度为30 ℃。研究结果明确了仙客来枯萎病病原菌的产孢条件，为仙客来枯萎病的感病机理、防治技术及孢子萌发抑制等研究奠定基础，同时对指导实际生产中科学管理、综合防治病害具有重要意义。

关键词 仙客来枯萎病；病原菌；产孢培养基；培养条件

中图分类号 S682.2+62  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）10-0159-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.10.035

Optimization of  Sporulation Medium and Culture Conditions of the  Pathogen of  Cyclamen Wilt Disease

SONG Zhuo-qin，  JIA Min-long，  LIANG Zheng et al

（College of Horticulture， Shanxi Agricultural University， Taiyuan，Shanxi  030031）

Abstract In order to obtain a high concentration spore suspension of the pathogen causing Cyclamen wilt disease， different nutrient media were preliminarily screened， and then orthogonal experiments were conducted to obtain the optimal nutrient ratio based on the initial screened nutrients. Furthermore， single factor experiments were conducted to screen the pH and culture temperature of the media. The results showed that potatoes， mung beans， and sucrose were the optimal nutritional components for the sporulation culture medium of the pathogen of Cyclamen wilt disease. The optimal ratio was mung bean 5.0%， sucrose 0.5%， and potato 20%. The optimal pH of the culture medium was 6， and the optimal culture temperature was 30 ℃. Clarifying the spore production conditions of the pathogen causing Cyclamen wilt disease lays the foundation for the research on the pathogenic mechanism， prevention and control techniques， and spore germination inhibition of Cyclamen wilt disease. At the same time， it is of great significance for guiding scientific management and comprehensive prevention and control of diseases in actual production.

Key words Cyclamen wilt disease;Pathogenic bacteria;Spore producing culture medium;Cultivation conditions

基金項目 山西省农业科学院优秀青年基金项目（YCX2020YQ11）。

作者简介 宋卓琴（1985—），女，山西屯留人，助理研究员，硕士，从事观赏植物生理、病理研究。

*通信作者，研究员，博士，从事观赏植物分子生物学和栽培育种研究。

收稿日期 2023-07-19

仙客来（Cyclamen persicum Mill.），是报春花科仙客来属多年生块茎花卉，原产于地中海东部沿岸、希腊、土耳其南部、叙利亚、塞浦路斯等地，花冠五裂片呈长椭圆形向上翻卷、扭曲，形似兔耳，亦称兔耳花、兔子花，且品种丰富，花期长达180～240 d，深受人们的喜爱［1-4］。2022年，仙客来全国的生产量达2 000万盆左右，是我国重要的年宵花卉。

枯萎病是仙客来主要的一个真菌病害，发病率在35%左右，病菌以菌丝体、分生孢子、厚垣孢子随病株残体在土壤中越冬［4-5］，其中菌丝体可在土壤中腐生存活3年，此病具有发生突然、蔓延迅速、致死率高的特点［6-7］。植株感病后表现为叶片局部或全部黄化、萎蔫，叶柄水渍化，表皮开裂，最后变褐，直到整株死亡［8-10］，严重影响仙客来观赏性和商品性，随着仙客来大范围种植及规模化生产，病害发生也逐渐加重，直接造成的损失可达2%～5%。

目前国内对仙客来病害的研究主要集中在病害的化学防治、生物防治及栽培管理等方面［4-8］，而对于仙客来枯萎病病原菌的研究很少。2019年笔者所在项目组在长子方兴仙客来种植基地采集枯萎病病株，并对病原菌进行了组织分离，经初步鉴定病原菌为尖孢镰刀菌。在此基础上，对病原菌的生物学特性开展了一系列的研究，主要针对仙客来枯萎病病原菌的培养基及培养条件进行了研究，通过培养基的初筛，及营养成分不同配比的正交试验，确定培养基配方，进一步优化培养条件，筛选出适宜病原菌生长的产孢培养基，从而探明仙客来枯萎病病原菌的生长特性，为仙客来枯萎病的病害防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

仙客来枯萎病病原菌由长子方兴仙客来生产基地的病株分离、纯化获得。采用科赫法则验证以及分子生物学鉴定确定该病原菌为尖孢镰刀菌，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 培养基

病原菌的活化采用PDA培养基，选取7种不同营养成分的培养基对病原菌进行培养，具体配方见表1。

1.3 培养基成分优化

分别选取马铃薯、绿豆、蔗糖的浓度作为3因素，每种因子设定3个水平，按正交表L9（34）（表2）组合的条件培养病原菌，每组试验重复3次。培养方法参考“1.6”，测定方法参考“1.8”。

1.4 培养基pH的优化

在“1.3”优化获得的培养基上分别比较培养基pH 4、5、6、7、8、9和10这7个梯度下的病原菌的生长情况及产孢情况。

1.5 培养温度的优化

在“1.4”优化的基础上分别比较培养温度为15、20、25、30、35 ℃时病原菌生长情况及产孢情况。

1.6 培养方法

将病原菌在PDA培养基上活化后，用5 mm的打孔器取菌落边缘长势一致的菌块接种至倒好培养基的培养皿中央，在28 ℃的无菌培养箱中进行培养。

1.7 病原菌孢子悬液制备

将培养7 d的平板用刮针刮取菌苔并用无菌水多次清洗全部移入三角瓶中，并在漩涡仪上充分振荡3 min，制得病原菌孢子悬浮液，用于孢子量的测定。

1.8 测定项目与方法

菌落生长速率的测定采用十字划线法，接种后第2天开始测定菌落的直径，连续测定5 d，菌落生长速率=菌落直径/5 d。孢子量的测定采用血球计数板计数法。

1.9 数据处理

试验数据采用Excel 2010 和SPSS 24.0 软件进行统计分析，采用LSD 法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同营养成分培养基培养下仙客来枯萎病病原菌的菌落生长情况及产孢情况

仙客来枯萎病病原菌在7种不同营养成分培养基长势不同，分生孢子产孢量差异显著。由图1可知，生长速率最快的是马铃薯培养基，PDA和PSA均显著高于其他培养基，其次是绿豆培养基，仙客来培养基生长最慢。由图2可知，绿豆培养基的产孢量最大，达10.40×107个/mL，其次是PSA和PDA，OA培养基产孢量均处于中等，CMA、香蕉、仙客来叶片培养基产孢量相对较少。PSA培养基生长的菌丝体最浓密，其次是绿豆培养基，CMA培养基菌丝生长最稀疏（图3）。综合考虑，选择绿豆、马铃薯、蔗糖作为营养成分进行下一步的正交试验，筛选最佳配比。

2.2 正交试验结果

根据产孢培养基的初筛结果，选择绿豆、蔗糖、马铃薯作为3因素，并设置3水平进行正交试验（表2），对培养基的主成分进行优化，得到最佳培养基组成。正交试验结果见表3，由R1可以看出RB>RA>RC，因此各因素对生长速率的影响B>A>C，即培养基中蔗糖含量对病原菌的生长速率影响最大，由R2可以看出RC>RA>RB，因此各因素对分生孢子总量的影响C>A>B，即培养基中马铃薯含量对病原菌的产孢量影响最大。从表4可以看出，各因素对病原菌生长速率的影响均达极显著水平，马铃薯含量对分生孢子总量的影响显著，因此，通过正交试验得出产孢培养基各因素的最佳比例为绿豆5.0%、蔗糖0.5%、马铃薯20%，产孢量达13.22×107个/mL。

2.3 基于正交试验结果的产孢培养基pH优化

以最佳培养基配方为基础培养基，将产孢培养基的pH调至4～10分别对病原菌进行培养，结果（图4）显示，病原菌的适应性很强，在pH为4～10时都能生长，pH为4～6时，随pH增大，病原菌的生长速率和产孢量均增加，当pH为6时，生长速率和产孢量均达最高，显著高于其他处理，当pH大于6时，随pH增大，病原菌的生長速率和产孢量逐渐降低，因此确定pH=6为病原菌的最适pH。

2.4 培养温度的优化

以最佳培养基配方为基础培养基，进行培养温度的优化。由图5可知，培养温度在15～30 ℃，病原菌的生长速率和产孢量均呈上升趋势，培养温度为30 ℃时，生长速率和产孢量均达到最大值，显著高于其他培养温度，生长速率达11.61 mm/d，产孢量达13.85×107个/mL，培养温度高于30 ℃后，病原菌的生长速率和产孢量迅速下降，35 ℃时最低，显著低于其他培养温度。因此，病原菌的最佳培养温度为30 ℃。

3 结论与讨论

对真菌的致病性、耐药性及抗真菌药物的研究中，快速大量获取孢子悬浮液是这些研究的前提条件［11］。对枯萎病及其病原菌产孢条件的研究较多，但自然界中各种作物枯萎病病原真菌的种类很多，致病性、产生色素、产孢条件以及产孢特点等有所差异［12］。张茂星等［13］设置不同硝/铵配比的

氮源、不同pH来培养香蕉枯萎病尖孢镰刀菌，并探明其最适生长条件。康萍芝等［14］研究了不同培养基对其菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响，明确尖孢镰刀菌黄瓜专化型的最适生长条件。该研究是以导致仙客来产生枯萎病的病原菌为研究对象，对其产孢培养基及培养条件进行研究。

该研究首先进行了初始培养基成分的筛选，研究PDA、PSA、CMA、绿豆培养基、香蕉培养基、仙客来培养基、OA 7种不同营养成分的培养基，病原菌生长及产孢量，结果表明生长速率最快的是马铃薯培养基，其次是绿豆培养基，产孢量最多的是绿豆培养基，达10.40×107个/mL，其次是马铃薯培养基，这与杨冬静等［15］的研究结果相似，马铃薯蔗糖培养基培养病原菌产孢量高，且大小均匀、形态整齐，绿豆培养基中孢子形态多样，更适用于对病原菌孢子的观察，而仙客来培养基可能由于在加热灭菌过程中破坏了其中的生长因子，反而不适宜病原菌生长。因此选出马铃薯、绿豆、蔗糖作为初始培养基主要营养成分。

正交试验法因其高效、经济的优点，广泛用于菌株培养条件的优化［16-17］。该研究根据产孢培养基的初筛结果，选择绿豆、蔗糖、马铃薯作为3因素，并设置3水平，进行正交试验，对培养基的主成分进行优化，得到最佳培养基组成，结果表明营养成分配比为绿豆5.0%、蔗糖0.5%、马铃薯20%，产孢量达到最高为13.22×107个/mL，此培养基培养的病原菌既可以获得最大孢子量，用于后续的病害防治、发病机理研究等，还可以满足对各种形态孢子的观察，对于病原菌的进一步鉴定非常有意义。

pH不仅可以影响细胞膜和溶液中物质的带电性，还可以影响菌株产酶活性，进而影响菌株对培养基中营养成分的吸收，通过单因素试验对初始培养基的pH及培养温度进行优化，确定其生长的最佳环境条件，对指导生产中环境的控制具有重要意义。该研究结果表明仙客来枯萎病病原菌的适应性很强，在pH为4～10都能生长，pH 6为病原菌的最适pH，这与秦涵淳等［18-19］的研究结果相似。温度作为影响微生物生长代谢的重要因素，在菌株发酵条件优化过程中至关重要［20］，菌种不同，可耐受的温度不同，该研究通过单因素试验结果表明培养温度30 ℃为病原菌的最适产孢温度，这与文增叶等［12］研究的三七根腐病病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性研究结果相似。

在仙客来盆花的实际生产中，基质pH要求控制在5.5～7.0，温度控制在15～30 ℃，夏季高温的情况下温度控制在25～30 ℃，这正好是病原菌最适生长的环境条件，很好地解释了夏季高温条件下仙客来枯萎病易发生的重要原因，该研究结果对于指导实际生产，如何从栽培管理的角度科学防治仙客来枯萎病的发生具有重要意义。但对于仙客来枯萎病的防治还需要深入研究，下一步将开展抑菌方面的研究。

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