基于GEO 数据库筛选非肌层浸润性膀胱癌吉西他滨耐药的免疫相关标志物

谢文亮 李明

膀胱癌是全球第十大常见癌症,2020年全球185个国家约有573 278个新发病例和212 536个死亡病例[1]。非肌层浸润性膀胱癌(non muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)是膀胱癌的主要类型之一,占原发性膀胱癌的70%。经尿道膀胱肿瘤切除术是目前治疗NMIBC 的主要方法。然而,以往的研究表明,经尿道膀胱肿瘤切除术后NMIBC 患者的5年复发率为31%～78%[2]。吉西他滨是NMIBC 患者术后的一线化疗药物,研究表明,NMIBC 患者行经尿道膀胱肿瘤切除术后即刻行膀胱内灌注吉西他滨药物化疗,可以降低5年复发率35%[3]。然而,长期的膀胱内灌注化疗会导致NMIBC患者对吉西他滨逐渐产生耐药性,进而导致肿瘤复发。因此,探索导致NMIBC 患者对吉西他滨产生耐药性的分子标志物具有重要意义。本研究使用生物信息学分析的方法筛选出导致NMIBC患者对吉西他滨产生耐药性的免疫相关核心基因,旨在提高对吉西他滨耐药的NMIBC 患者的精准治疗水平。

对象与方法

一、数据收集

从高通量基因表达(gene expression o mnibus,GEO)数据库(https://www.ncbi.nl m.nih.gov/geo)中获得微阵列数据集GSE77883,该数据集包括3 个对吉西他滨耐药的T24细胞系样本和3个非吉西他滨耐药的T24细胞系样本。利用免疫学数据库和分析门户网站 (https://www.i mmport.or g/ho me)和免疫互作和信号反应数据库(http://www.innatedb.com)获得免疫基因。

二、数据分析

1.差异表达基因的筛选:利用GEO2R 工具获取两组样本间的差异表达基因(differently expressed genes,DEGs)。以log FC>2和P<0.05作为筛选条件,筛选出两组样本间差异表达的上调基因;以log FC<2和P<0.05作为筛选条件,筛选出两组样本间差异表达的下调基因。

2.蛋白质互作网络的构建:利用蛋白-蛋白相互作用数据库(https://cn.string-db.org/)构建DEGs的蛋白质互作网络。用Cytoscape软件对蛋白质互作网络中各个节点的连接度进一步分析,以连接度大于10作为核心基因的筛选标准。通过核心基因与免疫基因的交集获取免疫相关核心基因。

3.功能注释和富集分析:在注释、可视化和综合发现数据库(The database f or annotation,visualization and integrated discovery,DAVID) (https://david.ncifcrf.gov/)中使用基因本体论(Gene Ontology,GO)分析对基因进行功能注释,内容包括生物过程、细胞成分以及分子功能。使用京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and geno mes,KEGG)分析进行基因功能的富集分析。

4.生存分析:在基因表达谱数据动态分析网站(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/)上对免疫相关核心基因进行生存分析。以P<0.05和95%CI作为筛选标准。

5.免疫浸润分析:在肿瘤免疫评估资源(Tu mor I mmune Esti mation Resource,TI MER)数据库(http://ti mer.cistro me.org/)中对NMIBC的免疫浸润进行系统分析,评估六种类型的免疫细胞浸润与免疫相关核心基因之间的关联性。

三、免疫相关核心基因表达水平的验证

阿拉巴马大学伯明翰分校癌症数据分析门户网站(The University of ALabama at Bir mingha m Cancer Data Analysis Portal,UALCAN)(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)包含癌症基因组图谱的转录组测序数据,用于验证核心基因的mRNA 表达。使用该数据库对免疫相关核心基因的表达水平进行验证。

结 果

根据GEO2R 的分析结果,一共得到917个DEGs,包括375个上调基因和542个下调基因,然后通过STRING 数据库和Cytoscape软件对DEGs的蛋白质互作网络中各个节点的连接度进行分析,得到85个核心基因。再将免疫基因和核心基因相交集,最终筛选出24个免疫相关核心基因,其中包括10 个 上 调 基 因:IL6、TNF、ICA M1、CXCR、CSF2、BMP2、SYK、WNT5 A、RELB 和FGF1;14 个 下 调 基 因:CDC42、TLR4、CCL2、CCR7、ITGB2、TLR3、F2R、S1PR1、PDGFA、IL-33、TNFSF10、FABP4、ANGPTL4和CXCL5。

通过GO 分析表明,免疫相关核心基因主要富集在白细胞介素-6产生的正向调节(生物过程)、质膜的整体成分(细胞成分)和肿瘤坏死因子受体结合(分子功能)。KEGG 富集分析结果显示,免疫相关核心基因在细胞因子-细胞因子受体相互作用通路中明显富集。

通过GEPIA 网站对24个免疫相关核心基因进行生存分 析,分析结 果 表 明S1PR1、IL33 和FGF1 与NMIBC 总 体生存密切相关。

基于TI MER 数据库,本研究分析了3个与生存最为相关的免疫相关核心基因和免疫细胞浸润之间的关系。结果显示,1-磷酸鞘氨醇Ⅰ型受体(sphingosine-1-phosphate typeⅠreceptor,S1PR1)的表达与不同的浸润性免疫细胞类型呈正相关,包括CD4+T 细胞(r=0.101,P=0.054)、中性粒细胞(r=0.204,P<0.001)和树突状细胞(r=0.050,P<0.001),CD8+T 细 胞(r=0.135,P=0.009),B 细 胞(r=0.123,P=0.019),与巨噬细胞(r=0.340,P<0.001)强烈相关;白介素33(interleukin-33,IL-33)的表达与CD8+T 细胞(r=0.109,P=0.038)、CD4+T 细 胞(r=0.114,P=0.029)、树突状细胞(r=0.025,P=0.628)、巨噬细胞(r=0.120,P=0.022)呈正相关,与中性粒细胞(r=0.210,P<0.001)强烈相关;成纤维细胞生长因子1(fibroblast growth factor 1,FGF1)的表达与CD8+T 细胞(r=0.237,P<0.001)、CD4+T 细胞(r=0.194,P<0.001)、树突状细胞(r=0.213,P<0.001)、中性粒细胞(r=0.264,P<0.001)呈正相关,与巨噬细胞(r=0.368,P<0.001)强烈相关。

使用UALCAN 数据库分析验证免疫相关核心基因的表达水平, 其中包含了19 个正常样本和22 个NMIBC 样本。分析结果显示,NMIBC 组织中FGF1、S1PR1 和IL-33的mRNA 表达水平均显著高于正常样本(P<0.05)。

讨 论

吉西他滨是一种脱氧胞苷核苷类似物,其主要作用是通过抑制DNA 的合成来抑制肿瘤细胞的增殖。NMIBC 患者行经尿道膀胱肿瘤切除术后即刻行膀胱内灌注吉西他滨可降低肿瘤复发率,但其缺点是肿瘤细胞易对吉西他滨产生耐药性。目前大多数NMIBC患者因发生化疗药物耐药而导致病情进展甚至死亡,对于耐药的分子机制仍不清楚。本研究通过生物信息学分析的方法探索NMIBC患者对吉西他滨产生耐药性的机制,筛选NMIBC 患者对吉西他滨产生耐药性的免疫相关核心基因。

根据综合性分析结果,本研究共获得了24个与免疫相关的核心基因。GO 和KEGG 富集分析表明,这些基因主要富集在白细胞介素-6产生的正向调节、质膜的整体成分、肿瘤坏死因子受体结合和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路等方面。生存分析结果表明,其中的3个免疫相关核心基因:S1PR1、IL-33和FGF1均与NMIBC 的生存预后密切相关,它们可能在吉西他滨耐药的NMIBC进展中发挥了作用。在查阅文献时笔者了解到Song等[4]对吉西他滨耐药的膀胱癌进行了生物信息学分析,但他们的研究主要针对MIBC 患者。本研究从NMIBC患者的角度出发,通过生物信息学分析确定NMIBC患者对吉西他滨产生耐药的免疫标志物。

S1PR1是一种鞘氨醇-1-磷酸的细胞表面受体,其通过刺激肿瘤细胞的血管生成、扩张、生长和转移来促进肿瘤的发生[5]。S1PR1是体内免疫细胞功能的重要调节因子,并在肿瘤相关巨噬细胞中发挥关键作用[6]。鞘氨醇-1-磷酸与巨噬细胞上的S1PR1偶联促进血管生成巨噬细胞表型,这是许多实体肿瘤中肿瘤浸润性免疫细胞的主要成分[7]。Go等[8]研究发现,S1PR1的过表达与NMIBC 中较差的临床病理学特征、P53表达以及STAT3激活有关。Lankadasari等[9]研究表明,在吉西他滨耐药的胰腺癌细胞中检测到S1PR1 表达增加。抑制S1PR1/STAT3信号通路,能够提高胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。然而,需要进一步的研究证实S1PR1在吉西他滨耐药的NMIBC中是否有同样的作用。

化疗药物耐药和肿瘤术后复发被认为是癌症患者死亡的主要原因。已有研究表明,IL-33的表达可诱导肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性。研究人员发现,与对照组相比,肿瘤细胞中IL-33基因的敲除显著降低了肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。其可能的机制是IL-33表达诱导肿瘤细胞向多倍体巨细胞转化,导致P53失活、细胞周期异常和细胞分裂缺失所致[10]。这提示IL-33可能通过诱导肿瘤细胞转化来诱导NMIBC患者对吉西他滨的耐药性。

FGF1 及其受体在许多肿瘤中都存在过表达,基于FGF1在组织再生和炎症过程中的重要作用,人们对FGF1信号在恶性肿瘤中的作用进行了广泛的研究[11]。Kostas等[12]研究发现,FGF1通过阻止细胞凋亡来促进肿瘤细胞增殖,其可能的机制是FGF1 通过细胞膜转移到胞浆和细胞核,激活下游的信号通路。Manousakidi等[13]研究发现,FGF1过表达诱导卵巢癌细胞对化疗药物的产生耐药性,其具体的机制是过表达的FGF1通过降低线粒体中P53的表达水平发挥抗肿瘤细胞凋亡作用。这提示FGF1 可能通过降低线粒体中P53的表达水平来诱导NMIBC 细胞对吉西他滨的耐药性。P53突变是膀胱癌中研究最广泛的基因之一,已被报道与肿瘤进展和化疗敏感性有关[14-15]。P53位于染色体17p13.1上,主要参与细胞增殖和凋亡的调控。有研究表明,P53免疫阴性的T1期膀胱癌患者的术后复发率为7%,而P53免疫阳性的T1期膀胱癌患者的术后复发率为62%[16-17]。本研究发现,免疫相关的核心基因S1PR1、IL-33和FGF1均与P53在NMIBC中的作用密切相关。

综上所述,本研究推测S1PR1、IL-33和FGF1可能是导致NMIBC患者对吉西他滨产生耐药性的免疫相关核心基因,并发现它们与P53 的作用密切相关。S1PR1、IL-33 和FGF1可被视为未来治疗对吉西他滨耐药的NMIBC 的潜在靶点。然而,S1PR1、IL-33 和FGF1 导致NMIBC 患者对吉西他滨产生耐药性的相关机制仍需进一步的分子生物学实验来研究和证实。