基于生物信息学分析糖酵解相关基因对DLBCL免疫微环境的影响

祁玉娇 刘聪聪 黄大帅 李红玲

基金项目：国家卫健委胃肠肿瘤诊治重点实验室2022年度硕博士/博士后基金项目（编号：NHCDP2022005）

作者簡介：祁玉娇（1994.3-），女，甘肃镇原县人，硕士研究生，主要从事淋巴瘤的研究

通讯作者：李红玲（1969.12-），女，甘肃兰州人，博士，主任医师，主要从事淋巴瘤的研究

摘要：目的  探讨基于糖酵解相关基因预测弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的肿瘤免疫微环境，并研究其潜在机制。方法  从NCICCR数据库中下载DLBCL患者的RNA-seq数据和相应的临床信息，基于糖酵解相关基因，采用共识聚类的方法将其分为C1簇和C2簇。采用Kaplan-Meier（K-M）生存分析、ESTIMATE、TIMER和ssGSEA分析来确定所识别的2个簇类之间的生存、功能和肿瘤微环境（TME）的差异性。通过GO、KEGG和GSEA功能分析阐明其潜在机制。结果  2个簇类之间的生存率显著不同；K-M生存曲线表明，C1簇的存活率高于C2簇，并且免疫评分、ESTIMATE评分与基质评分高于C2簇。GO和KEGG分析表明，两簇之间的差异性表达基因主要在细胞外基质和免疫途径中富集。GSEA分析显示，免疫通路在C1簇的富集度高于C2簇。结论  差异性表达基因于C1簇中与肿瘤免疫微环境显著相关，并且生存率高于C2簇。说明糖酵解代谢失调导致了肿瘤免疫微环境的损害，从而导致DLBCL预后不良。

关键词：弥漫大B细胞淋巴瘤；免疫微环境；糖酵解；预后

中图分类号：R733.4                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.09.001

文章编号：1006-1959（2024）09-0001-07

Effect of Glycolysis-related Genes on the Immune Microenvironment of DLBCL

Based on Bioinformatics Analysis

QI Yu-jiao1，LIU Cong-cong1，HUANG Da-shuai1，LI Hong-ling2

（1.College of Clinical Medicine，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China;

2.Department of Oncology，Gansu Provincial Hospital，Lanzhou 730000，Gansu，China）

Abstract：Objective  To explore the prediction of tumor immune microenvironment in diffuse large B-cell lymphoma （DLBCL） based on glycolysis-related genes， and to study its potential mechanism.Methods  The RNA-seq data and corresponding clinical information of DLBCL patients were downloaded from the NCICCR database. Based on the genes related to glycolysis， they were divided into C1 cluster and C2 cluster by consensus clustering method. Kaplan-Meier （K-M） survival analysis， ESTIMATE， TIMER， and ssGSEA analysis were used to determine differences in survival， function， and tumor microenvironment （TME） between the two identified cluster classes. The potential mechanism was elucidated by GO， KEGG and GSEA functional analysis.Results  The survival rates between the two clusters were significantly different. The K-M survival curve showed that the survival rate of C1 cluster was higher than that of C2 cluster， and the immune score， ESTIMATE score and matrix score were higher than those of C2 cluster. GO and KEGG analysis showed that the differentially expressed genes between the two clusters were mainly enriched in extracellular matrix and immune pathways. GSEA analysis showed that the enrichment of immune pathways in C1 cluster was higher than that in C2 cluster.Conclusion  Differentially expressed genes in C1 cluster are significantly associated with tumor immune microenvironment， and the survival rate is higher than that in C2 cluster. It indicates that the disorder of glycolysis metabolism leads to the damage of tumor immune microenvironment， which leads to the poor prognosis of DLBCL.

Key words：Diffuse large B-cell lymphoma;Immune microenvironment;Glycolysis;Prognosis

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma， DLBCL）是最常见的非霍奇金淋巴瘤（NHL）的类型，是以临床特点、免疫表型、疗效及预后等差异为主要表现的一组高度异质性疾病，约占我国全部NHL的37.9%[1]。基于利妥昔单抗的免疫化疗，近40%的DLBCL患者没有受益[2，3]。以利妥昔单抗为基础的R-CHOP加X方案也未能改善某些患者的总生存期（OS）[4]。许多新的治疗方法的出现，如抗CD19嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法虽已显示出对难治性和复发性弥漫性大B细胞淋巴瘤（R/R DLBCL）的显著疗效。但该疗法在近25%的患者中仍属失败[5]。因此，进一步探索一种针对DLBCL患者个体化靶向治疗的预后基因具有重要意义。

糖酵解（glycolysis）是指细胞膜上的葡萄糖转运体（GLUTs）将葡萄糖转运入胞内裂解为两分子丙酮酸的这一过程。研究者在上个世纪20年代已发现Warburg效应，即使在氧含量充足时，肿瘤细胞也会倾向于糖酵解进而代谢葡萄糖。糖酵解通路除了向机体供能，还可产生丙酮酸和6-磷酸葡萄糖，为肿瘤细胞提供合成脂肪酸和核苷酸所需的原料。此外，糖酵解产生的大量乳酸，可以分泌到细胞外产生一种导致细胞基质重塑的酸性微环境，从而帮助肿瘤的生长[6]。因此，靶向糖酵解已被认为是肿瘤治疗的一种新的治疗策略。

肿瘤微环境（TME）是以肿瘤细胞与基质元素、免疫细胞之间的相互作用为基础，对淋巴瘤的生存、治疗反应和病情进展或复发有重要影响[7]。但关于探讨DLBCL中糖酵解相关基因（GRGs）与肿瘤免疫微环境（TIME）之间的相互作用仍然比较浅。因此，本研究从生物信息数据库中收集与糖酵解相关的基因和数据，阐明糖酵解与DLBCL的TIME之间的关系，初步探讨糖酵解相关基因的潜在机制和生物学作用，以期为临床医生提供更准确的治疗方向。

1资料与方法

1.1数据来源  从癌症基因组数据库（NCICCR：https：//portal.gdc.cancer.gov/）中下载本研究所需的RNA-seq数据和对应的临床信息。纳入标准：①患者已明确诊断为DLBCL的数据样本；②表明基因表达矩阵和临床信息的样本；③临床信息完整的样本，包括年龄、性别、生存时间和生存状态；④若有配对样本，只包括1个。排除标准： ①正常组织样本；②无表达值的样本；③样本的表达值存在偏倚。从分子签名数据库[8]（MSigDB：gsea-msigdb.org）中共搜索GRGs集（BIOCARTA_GLYCOLYSIS_PATHWAY、HALLMARK_GLYCOLYSIS、KEG_GLYCOLYSIS_GL

UCONEOGENESIS、REACTOME_GLYCOLYSIS、WP_

GLYCOLYSIS_AND_GLUCONEOGENESIS）295个。

1.2方法

1.2.1 分子亚型的鉴定  首先，通过单因素Cox回归分析，发现56个GRGs与DLBCL的预后相关，采用共识聚类[9]进行聚类分析，使用凝聚层次聚类，对样本进行10次重复，利用经验累积分布函数图确定最优的聚类数。

1.2.2 肿瘤微环境分析  利用ESTIMATE算法[10，11]估计恶性肿瘤组织中的基质细胞，计算基质评分和免疫评分。采用TIMER免疫浸润分析[12]，计算6种免疫浸润细胞（B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞）的表达。

1.2.3 功能富集分析  利用R包“Limma”识别两个簇类之间的差异表达基因。基因本体论（GO）[13]分析和京都基因组百科全书（KEGG）分析[14]使用“clusterProfiler”包[15]来富集在MATESCAPE中可视化的相关通路。通过GSEA[16]基因集富集分析（http：//www.broadinstitute.org/gsea/index.JSP）进行基因集变异分析，以证明信号通路在两个簇之间的差异。

1.3统计学方法  所有统计分析和作图均采用R软件（版本4.0.2）和SangerBox软件（版本3.0）[17]完成。采用K-M进行生存分析，Log-rank检验分析整体生存率（OS）的差异。用t检验、非参数检验或？字2检验识别各变量之间的差异。P＜0.05视为差异有统计学意义。2结果

2.1鉴定GRGs的分子亚型  基于单变量Cox回归分析产生了56个与糖酵解相关的预后基因。采用共识聚类方法将DLBCL患者分为亚组。当出现K = 2时，组内平均一致性最高，确定了最优的聚类稳定性（图1A～图1C），233例患者聚为C1簇，248例患者聚为C2簇。通过热图可视化两种亚型中GRGs的表达水平（图1D），发现C1簇和C2簇之间存在明显的表达差异。此外，利用对数秩检验方法评估了不同组样本之间的预后差异显著性，最终观察到C1簇患者的总生存率优于C2簇患者的生存率（P=2.6e-5，图1E）。这些结果都表明，GRGs可以将DLBCL患者分为两种不同的分子亚型。

2.2两种亚型之间的TIME存在显著差异  ESTIMATE算法显示，在DLBCL患者中C1簇和C2簇之间的Stromal评分（P=1.0e-32）、Immune评分（P=8.0e-3）和ESTIMATE评分（P=1.2e-20）均有差异（图2A），并且C1簇的各项评分均高于C2簇。此外，TIMER算法顯示除B细胞（P=0.04）、CD8 T细胞（P=0.16）和巨噬细胞（P=0.06）无统计学意义外，C1簇的CD4 T细胞（P=4.6e-6）、中性粒细胞（P=4.7e-4）与树突状细胞（P=7.7e-9）的表达量均高于C2簇（图2B、图2C）。这些结果表明，C2簇的免疫状态和基质微环境相对较低，并且两种分子亚型的肿瘤微环境存在显著差异。

2.3 DEGs和功能富集分析  使用R软件包“limma”进行差异分析，获得两个簇之间的DEGs并进行功能富集分析，以探索其潜在的信号机制。共检测到196个DEGs，其中184个基因表达被上调，12个基因表达被下调（图3A）。为了进一步确定DEGs在两个簇之间的功能，采用“clusterProfiler”包得到基因的富集结果。KEGG富集分析显示，DEGs在细胞外基质和免疫相关的生物学过程中富集，包括ECM受体相互作用、癌症中PD-L1表达和PD-1检查点通路（图3B）。GO富集分析发现一些DEGs和免疫微环境相关的信号通路（图3C）。

2.4 MATESCAPE分析  网络富集图显示两个簇之间的DEGs明显富集于细胞外基质和免疫通路（图4A），PPI分析也确定了6个亚模型（图4B），其均表明两个簇之间的DEGs与肿瘤的发展密切相关。为了进一步探讨富集通路和DLBCL患者的预后关系，采用ssGSEA分析，对两个集群之间的通路相对表达差异进行评估，发现C1簇明显富集于免疫相关通路和细胞基质（图4C）。这些结果表明，GRGs的表达与DLBCL患者的TME和免疫密切相关。

3讨论

全球范围内最常见的非霍奇金淋巴瘤类型是弥漫大B细胞淋巴瘤，患者常表现为肿瘤肿块恶性生长[18]。采用R-CHOP方案，可治愈60%～70%的DLBCL患者。但是，仍有30%～40%的患者会出现复发，或者针对一小部分患者，采用此方案进行治疗后无效。对于能够忍受干细胞移植的年轻患者，通常会推荐自体干细胞移植疗法[19]。其中一部分患者疗效尚可，但有相当一部分患者仍不能通过这种方法治愈。目前迫切需要制定有效的风险分层方法和个性化的靶向治疗策略。在本研究中，鉴定了两个分子亚型，它们分别表现出显著不同的糖酵解景观。ESTIMATE分析显示，预后较差的患者基質评分均低于预后较好的患者。进一步的功能分析也显示GRGs与肿瘤微环境和免疫相关。

共识聚类是一种基于基因表达矩阵将样本分类为不同亚组的可靠方法。首先，基于GRGs表达矩阵，通过共识聚类确定了两个分子亚组，它们的总生存率也有显著差异，然后对它们依次进行免疫和功能分析，探讨糖酵解在DLBCL中的作用。

由于肿瘤进展与周围间质改变有关，免疫细胞是肿瘤间质的关键成分[20]，因此TIME对患者的预后起着至关重要的作用。此外，肿瘤细胞的代谢状态异常会导致TIME的代谢变化。ESTIMATE算法是一种创新的方法[10]，根据基因表达值来推断肿瘤的纯度，免疫细胞和间质细胞在肿瘤中所占的比例。通过ESTIMATE算法将肿瘤样本中的免疫成分定量地显示，并对TIME进行了反映。此前，有研究[21]已证实免疫功能与DLBCL的不良预后有关。本研究显示，预后效果更好的患者获得了更高的免疫评级，这与此前的报告相符。此外，本研究应用TIMER来评估这两个分子亚群的免疫状态。TIMER是一种对6个肿瘤浸润性免疫亚群进行定量帮助的网络工具。TIMER分析显示，在簇2中，6个免疫细胞中有3个的丰度明显降低，因此，可以假设免疫状态可能与不良预后有关。

基于已鉴定的DEGs、GO分析、KEGG分析和MATESCAPE分析协同提示，免疫失调和细胞外基质失调可能介导糖酵解在DLBCL发生发展中的作用。因此，本研究进行了GSEA分析，对其潜在机理进行了进一步明确。GSEA分析是一种整合基因表达信息，明确不同组基因集表达趋势的方法。在本研究中，GSEA分析出了与KEGG、GO富集相关通路一致的结果。这些结果均表明，GRGs的表达与DLBCL患者的免疫失调和不良预后有关。

通过上述生物信息学分析得出：糖酵解代谢失调导致了TIME的损害，从而导致DLBCL预后不良。因此，干扰糖代谢途径对治疗DLBCL患者有重要价值，多条证据表明，葡萄糖代谢赋予DLBCL肿瘤细胞能量和生存特权，可以满足肿瘤细胞的生物能量和生物合成的需求。未来的研究需要揭示糖酵解在DLBCL过程中的作用，这些研究可能会确定用于治疗该疾病患者的新的代谢靶点。

综上所述，本研究通过共识聚类的方法在DLBCL中确定了两种分子亚型。采用TIME分析和功能富集分析显示，糖酵解会导致肿瘤免疫微环境失调，从而导致预后不良。

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收稿日期：2023-09-09；修回日期：2023-09-24

編辑/成森