基于Tb-OBBA-Hemin纳米酶测定人血清中左氧氟沙星含量

叶 强

(自贡市轻工业设计研究院，四川 自贡 643000)

左氧氟沙星是一种喹诺酮类药物，具有广谱的抗菌作用[1]。对大多数肠杆菌科细菌，如沙门菌属、变形杆菌属、志贺菌属等革兰阴性菌有较强的抗菌活性，在临床上有着广泛的应用。一般而言，静脉注射后，可在24 h内排泄完全，口服后，在12 h内可排泄完全。但对于肾病综合征以及肾功能不全的患者，由于不能及时排泄，持续常规剂量给药会造成严重的不良反应，因此，准确监测此类患者体内的血药浓度，就显得尤为重要。

左氧氟沙星的主要检测方法有高效液相色谱法[2]、紫外-可见分光光度法[3]、拉曼光谱法[4]、分子荧光法[5]等。其中高效液相色谱法是最为常用的方法，但存在前处理复杂，分析时间长等缺点。传统的紫外-可见分光光度法灵敏度较低，一般用于检测注射液或滴眼液等高浓度左氧氟沙星，SERS(表面增强拉曼光谱)需要使用特定的增强剂，且仪器价格昂贵，不能满足对血液中左氧氟沙星浓度进行快速、准确分析的需求.

纳米酶是具有酶样特性的纳米材料，与天然酶相比，纳米酶具有催化活性高、成本低廉、易于生产和稳定性可靠等优点。基于人工纳米酶的以上优点，我们设计出通过Tb-OBBA-Hemin检测血液中左氧氟沙星的新方法。检测体系由Tb-OBBA-Hemin、过氧化氢、TMB组成，当样本中不含有左氧氟沙星时，自身的拟过氧化物酶活性较弱，催化过氧化氢将TMB氧化为ox-TMB的能力较弱，因此体系呈浅蓝色。当样本中含有左氧氟沙星时，左氧氟沙星能显著提高Tb-OBBA-Hemin的拟过氧化物酶活性，在一定范围内，左氧氟沙星浓度越高，酶活提高越明显。因此，当TMB、过氧化氢、Tb-OBBA-Hemin的浓度相同时，吸光度大小与左氧氟沙星含量成正比。按照实验方法测定了3个人血清样本中左氧氟沙星，结果的精密度和准确度令人满意。检验结果可以满足临床用药指导的需求。

1 实 验

1.1 主要试剂

4，4’-二苯醚二甲酸(简称OBBA，0.1 mol/L，称取1.29 g 4,4’-二苯醚二甲酸于50 mL DMFO中)；氯化血红素(简称Hemin，0.1 mol/L，称取3.255 g氯化血红素于50 mL DMFO中)；硝酸铽(0.1 mol/L，称取2.085 g硝酸铽四水合物于50 mL水中)；3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(简称TMB，5 mmol/L，称取0.28 g 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶于50 mL无水乙醇中，超声中放置5 min，促进溶解)；过氧化氢(50 mmol/L，吸取0.1 mL 30%过氧化氢，加20 mL水，摇匀，冰箱内保存)；左氧氟沙星标准溶液(1 000μg/mL，取0.100 0 g盐酸左氧氟沙星标准对照品，溶于水中，转入100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀)；左氧氟沙星标准溶液(100 μg/mL，吸取10.00 mL 1 000 μg/mL左氧氟沙星标准溶液，转入100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀)；左氧氟沙星标准溶液(10 μg/mL，吸取10.00 mL 100 μg/mL左氧氟沙星标准溶液，转入100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀)。

1.2 仪 器

TU-1901紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器公司；101型鼓风干燥箱，北京永光明仪器设备公司；L420实验室离心机，长沙湘仪实验室仪器公司。

1.3 Tb-OBBA-Hemin的制备

吸取1 mL硝酸铽于水热釜中，加入2 mL OBBA，0.5 mL Hemin，7 mL DMSO，磁力搅拌20 min，放入烘箱中，135 ℃反应5 h，取出，离心分离，弃去上层清液，用100 mL无水乙醇分三次洗涤沉淀，低温烘干备用。称取25 mg干燥后的Tb-OBBA-Hemin，分散在10 mL水中。

1.4 血清中左氧氟沙星的测定

用校准后的移液枪吸取50 μL血清样品于1.5 mL EP管中，加入0.45 mL甲醇，剧烈震荡30 s，用桌面离心机离心1 min，备用。吸取200 μL试液于5 mL比色管中，在沸水浴上蒸干甲醇，加入1 mL水，100 μL Tb-OBBA-Hemin，放置1 min，加入50 μL 50 mM过氧化氢，100 μL 5 mM TMB，10 min后再654 nm处，以水为参比，测定吸光度，并从工作曲线上查出样品溶液中左氧氟沙星浓度。

标准曲线的绘制：分别吸取0、10、25、50、100、200、500 μL 10 μg/mL左氧氟沙星标准溶液于5 mL比色管中，加水至1 mL，其余同样品测定。

1.5 结果计算

式中：c左氧氟沙星为血清中左氧氟沙星浓度，μg/mL；V为试样溶液总体积，mL；V0为试样溶液中含有血清的体积，mL。

2 结果与讨论

2.1 Tb-OBBA-Hemin的制备

Tb-OBBA-Hemin是一种人工合成的纳米材料，具有拟过氧化物酶活性。Tb作为中心原子，通过调节OBBA和Hemin的用量，可以调节其过氧化物酶活性。制备几种不同OBBA和Hemin用量的Tb-OBBA-Hemin，分别测定其拟过氧化物酶活性，结果如图1所示，当增加OBBA用量，体系吸光度降低，当增加Hemin的用量时，体系吸光度增加。说明改变Hemin用量，对拟过氧化物酶活性具有调控作用。

图1 OBBA与Hemin用量与过氧化物酶活性的关系Fig.1 Relationship between OBBA and Hemin dosage and peroxidase activity

拟过氧化物酶活性较强时，空白吸光度较高，不利于测定的进行，因此我们选用Hemin与OBBA的用量为0.5 mL和2 mL。

2.2 血清的处理

血清中含有的蛋白质不仅使试液变得浑浊，还会阻碍TMB的氧化，最终导致测试的失败，因此血清中的蛋白质必须要予以除去。常见的除蛋白方式有三氯乙酸沉淀法、硫酸锌-氢氧化钡沉淀法、有机溶剂沉淀法等。三氯乙酸具有强烈的腐蚀性，且处理完后需要进行中和。硫酸锌-氢氧化钡沉淀法是卫生部血糖测定的推荐前处理方法，脱除蛋白彻底，但是操作极其繁琐，耗时较长，不能满足快速测定的需要。有机溶剂沉淀法具有操作简便、血清用量少、蛋白脱除率高等优点。因此，我们选用有机溶剂沉淀法脱除蛋白质。为考察不同有机溶剂脱除蛋白质的效果，使用左氧氟沙星浓度为20 μg/mL的人工配制血清，分别采用乙醇、甲醇、乙腈、丙酮处理，然后测定左氧氟沙星浓度，结果如表1所示。

表1 不同溶剂处理血清样本的效果Table 1 Effect of different solvents in treating serum samples

乙醇处理后的样品，显色后溶液呈红色，证明蛋白质没有除干净，不能采用。甲醇处理后的样品，测定结果偏低，不能满足要求。丙酮和乙腈处理后血清样品，测定值与配制值误差很小，均可使用，但丙酮易挥发，后续处理方便，因此，我们采用丙酮处理血清样品。

2.3 底物的选择

底物的选择，直接关系到检测体系的灵敏度与稳定性，在5 mL比色管中，分别加入100 μL Tb-OBBA-Hemin，稀释到1 mL，加入100 μL 0.01 mg/mL的左氧氟沙星标准溶液，放置1 min，分别加入100 μL 5 mM ABTS、TMB、OPD，50 μL 50 mM过氧化氢，10 min后测定体系400～800 nm的吸收光谱。如图2所示，三种底物均能在Tb-OBBA-Hemin的催化下被过氧化氢氧化，ABTS的吸光度最低，灵敏度较差。OPD易氧化变质，需要现用现配，且灵敏度没有TMB高。TMB在相同条件下具有最高的吸光度，性质稳定，可以长期存放。因此，底物我们确定为TMB。

图2 不同底物的吸收光谱Fig.2 Absorption spectra of different substrates

图3 共存物对检测体系的影响Fig.3 Effect of co-existing substances on the detection system

2.4 共存物干扰及消除

2.5 样品分析

根据上述优化得到的实验条件，绘制工作曲线，并对自贡市第一人民医院的三名志愿者的血清样品分别平行测定8次。结果表明，通过上述方法绘制的工作曲线线性良好(如图4所示)，测定结果相对标准偏差(RSD，n=8)分别为：2.31%、3.87%、2.93%。

图4 左氧氟沙星线性关系Fig.4 Linear relationship of levofloxacin

为验证方法的准确性，我们在两份样品中分别加入不同浓度的左氧氟沙星标准溶液，然后进行测定加标回收率，实验数据如表2所示。

表2 人血清样本加标回收率Table 2 Human serum sample spiked recovery

3 结 论

血清样品经过脱蛋白处理后，用Tb-OBBA-Hemin分光光度法测定其中的左氧氟沙星含量，方法简便易行，血清中其他共存物质对左氧氟沙星的测定没有干扰。对实际样品进行测定，测定结果相对标准偏差(RSD)在2.31%～3.87%之间，样品加标回收率在93.6%～101.9%之间，方法精密度和准确度能够满足临床患者的用药指导要求，可应用于实际临床样本的产生。