2D-LC 与质谱联用技术及其在药物质量研究中的应用

车雨轩，赵云丽，王东凯

（沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016）

液相色谱—质谱联用法（LC-MS）是以液相色谱为分离手段，以质谱为鉴别方法的分离分析方法。目前，质谱已经存在多种类型，如四极杆质谱（QMS）、离子阱质谱（ITMS）、飞行时间质谱（TOF）、三重四极杆复合线性离子阱质谱（Q-Trap）、三重四极杆复合飞行时间质谱（QTOF）和离子阱复合飞行时间质谱（IT-TOF）等[1]，其优点在于可以得到多级质谱图以推测有机物的裂解方式及其分子结构，灵敏度高、选择性高、分析速度快等。通过和液相色谱联用后，与其分离能力强的优点相结合，为现代药物研究提供了宝贵的分析技术手段。但是，由于一维峰容量有限，难免会存在难以发现的共流出组分；此外，在液相色谱使用过程中，通常流动相中会添加非挥发性的缓冲盐，如磷酸盐，或者加入离子对试剂来改善分离效果，使其达到理想分离度，但这些成分并不能直接进入质谱，即液相系统与质谱系统不相容，这对液质联用技术有着很大的局限性。但近年来，二维液相色谱（2D-LC）与质谱联用技术弥补了液质联用技术的缺点。

1 2D-LC 与质谱联用技术介绍

1.1 2D-LC 技术

2D-LC 技术为多维液相色谱技术的典型代表，二维即由两个分离机制不同的色谱柱通过接口技术串联而成，其中第一维可以是一根或者多根分离机制相同的色谱柱串联而成；第二维可以是一根或者多跟分离机制相同或者不同的色谱柱串联而成[2]。样品通过一维色谱的分离后，经过接口技术进入第二维色谱柱进行进一步的分离，以此减少了成分之间的重叠，有效地扩大了峰容量[3]，也解决了一维色谱的共流出问题。此外，一般一维与二维的分离机制不同可以提高二维液相色谱的正交性以此达到理想的分离效果。其正交性越高分析，效果越好。但也有例外，Feng Hu 等[4]选择了对立体异构体保留相对较弱的 IB 柱用作一维分离柱，而对立体异构体保留较强的 IF3和 IC 柱用作二维分离柱，对泊沙康唑中的 12 种相关异构体进行了分析，得到了理想的结果。这表明手性—手性多中心切割二维液相色谱也能够有足够的正交性，能够分离含有多个不对称中心的手性药物立体异构体。2D-LC 技术先已用于食品、中药、生物样本以及复杂基质样品或手性化合物等难分离混合物的分离分析[5-8]。

1.1.1 2D-LC 的分类

2D-LC 可根据第一维分离后是否直接进入下一维分为在线模式和离线模式，在线模式能够选择性将一维色谱的馏分转移到二维色谱柱当中，能更好地解决常规色谱分离有限的问题[9-11]；离线模式没有流动相兼容问题，所以可以选择不同分离机制的色谱柱串联，但其也存在转移过程中容易损失样品、重现性差、耗时费力等问题[12]。其次，在线 2D-LC 技术还可以分为中心切割模式与全二维模式，其中心切割模式还可分为单中心切割模式与多中心切割模式[13]。中心切割模式即将一维色谱中的某一个或者某一些成分转移到二维色谱中继续分析；而全二维模式则是将一维色谱中的全部成分转移到二维色谱中继续分析。

1.1.2 目前商品化的 2D-LC

目前，商品化的二维液相色谱已有安捷伦公司发售的 1290 Infinity II，其可选择具有高分辨采样功能的多中心切割二维液相色谱和全二维液相色谱模式；岛津公司发售的 Nexera-e，其可提供全二维液相色谱。

1.1.3 2D-LC 的接口技术

2D-LC 的接口技术即为将第一维色谱中的洗脱成分定量转移到第二位色谱柱上的阀切换技术，它不仅是一维色谱的收集器也是二维色谱的进样器，故成为 2D-LC 的技术的关键核心。

其主要分为样品环储存技术、捕集柱切换技术和平行柱交替技术三种[14]。首先，样品环储存技术的定量环会受到样品量的限制，如果用其对一维的宽峰进行分析，则需要对宽峰进行多次切割最后通过多次数据拼接得出数据，这会导致一定的数据误差[15]；捕集柱技术则是在一维与二维色谱系统之间加入一个用于捕集样品的色谱柱，这显著提高了可以收集的样品量，弥补了样品环储存技术的缺点，但同时，由于捕集柱的存在需要考虑其捕集和洗脱的方法与条件，会消耗一定的时间[16]；平行柱技术即直接转移入选择性的第二维色谱柱上。具体的接口技术选择可根据被分析的物质的性质来决定。

1.2 2D-LC 质谱联用技术

在使用液相色谱的过程中，通常在流动相中添加一定的缓冲盐类来得到理想的分离效果。但是，对于质谱来说非挥发性缓冲盐会污染离子源。所以，在液质联用时要避免使用非挥发性缓冲盐，这对液质联用技术的应用范围产生了局限性。然而，2D-LC 通过其在线脱盐技术完美地解决了其不相容的问题。

被分析物质通过一维色谱分离分析后，通过接口技术将其浓缩，转移到二维色谱柱上后，随着二维色谱的与质谱相容的流动相进行洗脱分离，这样就解决了不相容的问题。再通过其在线脱盐技术将先洗脱出二维色谱柱的非挥发缓冲盐类通过阀切换技术排入废液，而其余待测组分进入质谱分析。2D-LC 质谱联用技术弥补了传统液质联用的缺陷，将 2D-LC 的强大的分离能力与质谱的强大定性鉴别能力相结合，得到物质的结构信息，这为药物的分析提供了宝贵的提升空间[17]。

1.2.1 2D-LC 质谱接口技术与质谱类型

2D-LC 质谱接口即为质谱的离子源，目前，其常用的两种主要接口为电喷雾离子化接口（ESI）与大气压化学离子化接口（APCI）。其中，ESI 的电离过程为待分析物在流动相中形成带电离子后，在雾化器作用下形成带电液滴，后通过加热不断使溶剂蒸发，发生库伦爆炸最后形成分析物离子； APCI 的电离过程为流动相与分析物在高温下，与形成含有气溶胶的分析物后溶剂在蒸发器中蒸发形成蒸汽，通过电晕针放电形成带电荷的反应剂离子后，与待分析物分子发生分析离子反应，电荷转移至分析物分子，形成分析物离子。由于两种接口的原理不同，故导致其应用范围不同，且对流动相的要求也不同，如 APCI 其化合物必须要具有一定的挥发性，要求必须是热稳定的，其有机溶剂也应该是很好的电荷交换剂；ESI 溶液的 pH 要求调到可以生成离子的范围。

质谱分为四极杆质量分析器（Q）、离子阱质量分析器（Trap）、飞行时间质量分析器（TOF），其各有优点与缺点，同时单一质量分析器难以获得多种碎片离子，这对其定性定量能力有所局限。为了获得更加丰富的碎片离子信息，提高质谱分辨率能力，已经研究出多种串联质谱，并且应用于液质联用技术当中，使分析技术水平更上一层楼。

目前，常用的串联质谱有以下几种：①三重四极杆质量分析器（QQQ）：是由三个串联的四极杆组成，可实现二级质谱分析，并且有产物离子扫描、前体离子扫描、中性丢失扫描三种扫描模式，定量能力非常好，提高了传统四极杆的定量能力，但其分辨率不足。②线性离子阱质量分析器：能够实现多级质谱分析，比传统离子阱分辨率高了 10 倍以上，但其不能实现多种扫描方式。③四极杆飞行时间串联质谱（QTOF）：以四极杆作为质量过滤器，飞行时间作为质量分析器，其定性能力好于QQQ，并且分析速度快。④离子阱飞行时间质谱（Trap）：综合了离子阱的多级质谱分析能力与飞行时间的高分辨率。⑤静电场轨道阱（Orbitrap）：它的问世使高分率质谱能力更上一层楼。⑥四极杆静电场轨道阱质谱（Q Exactive）：可对复杂样品中的小分子或大分子实现高质量精度的测定，确保定性和定量结果的准确性。

2 2D-LC 质谱联用技术在药物杂质分析中的应用

药物的杂质一直是药物质量控制的研究重点，杂质会影响的药物的安全有效性。ICH 中明确规定，要对新原料药中含量大于鉴定限度的杂质进行结构确证。并且，对于在推荐条件下进行稳定性研究中发现的大于鉴定限度的降解产物也要进行结构确证[18]。随着技术的进步，从液相色谱到液质联用技术，再到 2D-LC 质谱联用技术，在不断的为药物的杂质研究提供新的进展。质谱作为强大的定性鉴别的技术手段，是杂质分析不可或缺的一部分，但因其不能与非挥发性盐类相容，导致药典中许多杂质检查方法不能应用于质谱。但 2D-LC 质谱联用技术的在线脱盐技术解决了这一困境，使很多药典方法可以应用于质谱当中，使得色谱图可以与药典方法对应。同时，基于 2D-LC 能够解决共流出的问题，可以发现更多之前未被定性鉴别过的未知杂质，这让药物的质量安全得到了进一步的保障。

孙玉双等[19]利用 2D-LC-HR-MS/MS 对头孢唑啉钠中的 2 个未知杂质进行了结果鉴定，并推测了其生成的途径。其中，2D-LC 技术完美的解决了其非挥发性盐的色谱系统与质谱不相容的问题。Jian Wang 等[20]利用 2D-LC–QTOF/MS/MS 和 NMR 对罗红霉素中的两种未知杂质进行了结构确证。Mi Luo 等[21]运用 2D-LC-QTOF/MS/MS 对二甲双胍的四种降解产物进行了结构确证。赵敬丹等[22]人利用二维液相色谱四级杆飞行时间质谱法定性鉴别了盐酸特比萘芬中的一种弱极性未知杂质，这为复杂基质样品中微量杂质的分析鉴别提供了思路。阮昊等[23]开发二维高效凝胶色谱—反相色谱—质谱联用对注射阿洛西林钠中的聚合物杂质进行了分离分析，得到了 4 种聚合物杂质，该实验为有效控制β-内酰胺抗生素中的聚合物杂质提供了新思路。徐明明等[24]利用在线二维液相色谱—四极杆飞行时间质谱法对二丁酰磷腺苷钙的 7 个杂质进行了结构鉴定，并尝试建立了其杂质谱。韩彬等[25]利用2D-LC-IT-TOF-MS 对他克莫司原料药的有关物质进行分析，利用 2D-LC 解决了子囊霉素杂质和他克莫司异构体 Ⅰ 出峰时间很接近，在对应的时间处样品中只检出一个色谱峰的问题。Jian Wang 等[26]利用 2D-LC-IT-TOF-MS 技术建立了一种对地奈德乳膏杂质的检查方法，以此对美国药典中的杂质检查方法改进，解决了其一种光解杂质与地奈德共流出的问题，并对此杂质进行了结果确证。

3 2D-LC 质谱联用技术在中药质量研究的应用

中药是中华传统文化的瑰宝，近年来，中药因其疗效显著、副作用小等特点受到了广泛关注。但是中药的质量控制一直是其中药分析的研究关键，只有建立完善的中药质量控制体系才能保证中药的安全有效性。然而由于中药成分的复杂，并且每种成分的含量和极性差异很大，中药的质量控制也一直是其难点。随着液质联用技术的发展，其优点为中药的质量控制提供了新的思路。但是，传统一维液相色谱的峰容量相对于中药的复杂化学成分还是不够的，这导致很多低含量的成分会被忽略；同时还会因为共流出而导致分离度变差。二维液相色谱的出现极大地提高了峰容量，并且通过提高二维色谱的正交性可以得到理想的分离效果，这为中药的分析发展提供了新的技术支持。

3.1 在中药材与中药饮片中的应用

中药材与中药饮片是中药的基础，相当于中药的“原料药”，所以，对中药材与中药饮片来说，可靠的质量控制是保证中药质量的首要关键，但因其组成成分复杂，一维液相色谱质谱联用能够对其进行分离表征的化合物有限，不过，2D-LC 质谱联用技术因其高正交性与高峰容量为其全面表征创造了机会。

Yuexin Qian 等[27]利用离线 2D-LC/IM-TOF-MS 技术对白术进行了深入的多组分表征，通过亲水相互作用色谱与混合离子交换反相色谱的串联实现了高正交性和二维色谱的高峰容量对白术的 251 种成分进行了鉴定和初步表征，这为中药草药的组分表征提供了新思路。Tiantian Zuo 等[28]利用离线 2D-LC/IM-QTOF-HDMS 分离和表征了白参和红参中的 323 种人参皂苷。奎诺查酮C-糖苷（QCG）作为红花的一类具有生物活性的成分，其分离表征一直受到黄酮 O-糖苷（FOG）的干扰Wenzhi Yang 等[29]利用离线2D LC/LTQ-Orbitrap MS 技术，组合 Acchrom XAmide 色谱柱和BEH Shield RP-18 色谱柱的色谱系统，解决了这种干扰，并且分离表征了 163 个 QCQ 同源物。其中 149 个是潜在的新同源物。Li-Juan Ma 等[30]利用二维液相色谱—轨道阱高分辨质谱以不同的干燥方法对三七叶化学成分的影响进行了分析，研究发现，由晒干和 50℃ 热风干燥处理的三七叶中发生强烈的人参皂苷转化；但通过晒干、25℃ 热风干燥和干燥前的蒸汽处理，则不会发生转化，这为确定三七叶质量的干燥方法提供了依据。

3.2 在中成药中的应用

2D-LC 质谱联用技术不仅可以帮助中药材进行表征，也可以对更为复杂的中成药进行表征，这为中成药的质量控制提供了新的依据。

Chen Wang 等[31]利用离线的二维液相色谱和四极杆—Orbitrap 质谱系统对培元通胶囊进行质量评价，分离了 178 种化合物，其中 96 种被鉴定，而且选取了 10 种活性化合物作为质量标志物（Q-maker），联合调整平行反应监测的方法定量分析了了 14 批样品，实现了培元通胶囊的综合多组分表征、鉴定和质量评估的研究。Shuai Ji 等[32]开发了离线亲水相互作用×反相二维液相色谱的方法全面分析了桑菊感冒片的成分，其分离得到了 456 个峰，并通过四极杆飞行时间质谱对其中 54 个化合物进行了鉴定和表征，其中 12 个化合物是首次发现，这为探索中药药材配伍的机制提供了帮助。

4 总结与展望

综上所述，随着 2D-LC 质谱联用技术的不断发展，弥补了传统液质联用技术在共流出问题和非挥发性缓冲盐类与质谱不相容的短板，使得药物分析得到了更深一步的发展，也将不断完善药物的质量标准，让药物更加的安全有效。同时，随着 2D-LC 质谱联用技术的出现，也将为其他药学研究提供新的技术手段，如在阐述药物作用机理和一些病理机制方面，2D-LC 质谱联用技术也存在着巨大的应用前景。