2023年度液体活检标志物研究进展年终盘点

谢丽 宋现让

作者单位：250117 济南 山东第一医科大学附属肿瘤医院

生物标志物是一种能客观测量并评价正常生物过程、病理过程或对药物干预反应的指示物。2023年，随着免疫学、分子生物学和基因组学技术的发展，液体活检技术发现了更多有价值的生物标志物，这些生物标志物的发现有助于临床医师了解肿瘤发生和发展的分子机制，为肿瘤的早期诊断和治疗提供了重要的参考依据。

液体活检技术作为一种新兴的检测技术，具有创伤小、可重复性强、成本低等优点，可以非侵入性地反映体内肿瘤的状态，在肿瘤筛检中具有广阔的应用前景，能为肿瘤的早期诊断、个体化治疗监测以及预后判断提供有力依据。液体活检来源涵盖了不同类型的肿瘤相关物质，其中肿瘤来源的生物标志物主要包括循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）、细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）、非编码RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）和肿瘤教育血小板（tumor-educated platelets，TEPs）等。2023 年，液体活检标志物在肿瘤诊断和治疗领域的应用更加深入和广泛，本文就其研究新进展进行盘点。

1 液体活检标志物检测技术的新进展

1.1 ctDNA

CHENG 等［1］使用广谱游离DNA测序在血浆中鉴定了一类新型约50 nt超短单链游离DNA，它与167 bp单核小体游离细胞DNA 明显不同，具有不同的生物学过程以及功能元素（functional element，FE）峰、片段组学、末端基序和G-四联体（G-Quod）特征，可作为一类独特的生物标志物。有研究通过甲基化敏感高分辨率PCR方法分析肝细胞癌（hepatocellular cancer，HCC）患者ctDNA 中无名指蛋白135（ring finger protein 135，RNF135）和乳酸脱氢酶B（lactate dehydrogenase B，LDHB）的甲基化水平，并基于此开发了甲基化敏感高分辩率分析（MS-HRM），结果显示，MS-HRM RNFB5和LDHB 组合可以检测到57%的HCC，在同等特异度下优于甲胎蛋白检测的45%的灵敏度，当与甲胎蛋白联合使用时，灵敏度可以提高至70%，证实ctDNA 甲基化测定也可用于肿瘤液体活检［2］。SAURA 等［3］从乳腺癌患者收集的母乳中发现存在ctDNA，通过液滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）分析母乳的ctDNA，结果在87%的病例中检测到肿瘤变异，而在92%的匹配血浆样本中仍未检测到变异，其检测敏感度为71.4%，特异度为100.0%，此外在乳腺癌临床诊断前18个月和6个月收集的母乳中也可检测到ctDNA。该研究开辟了母乳作为液体活检新来源的潜在用途。

1.2 CTCs

CTCs 因在整个循环血液中的浓度极低，检测的灵敏度有限。2023 年，STOECKLEIN 等［4］通过采用诊断性白细胞分离术（diagnostic leukapheresis，DLA）来筛查大血量（中位处理血量约为2.8 L）以提高CTC 检测的灵敏度，结果发现DLA 能将M0 期胰腺癌患者的CTC 检出率提高到44%，在M1 期患者中提高到74%，同时可使CTC 计数增加了60 倍，从而为基因组分析提供足够的CTC。这种大容量液体活检策略通过提供充足的CTC材料，增强了其作为可靠液体活检方法的实用性，有望作为识别高危肿瘤患者和帮助优化多模式治疗策略的可行手段。

1.3 EVs

EVs 是液体活检的理想选择，但区分肿瘤衍生的EVs 和体液中含有生物标志物的EVs 亚群一直具有挑战性。2023 年，KO 等［5］发现糖蛋白CD147+EV 主要来源于肿瘤细胞，与健康个体和良性疾病患者相比，循环中的CD147+EVs 在卵巢癌和肾癌患者的阳性率显著增加。该研究还发现，通过CD147免疫捕获分离的循环miRNA 较通过常规方法分离的循环miRNA 更接近反映肿瘤miRNA 的特征，因此CD147免疫捕获可能是分离肿瘤衍生miRNA 进行液体活检的有效方法。

膜蛋白是细胞外囊泡和颗粒（extracellular vesicles and particles，EVPs）常用的标志物，但无法满足临床要求的诊断准确性。ZHAI 等［6］用干涉等离子体显微镜研究膜蛋白表达水平、适配体的结合动力学和EVPs大小之间的相关性，结果发现5种蛋白质标志物的选择性膜蛋白表达水平及其结合动力学在各种大小的EVPs 中具有高度异质性，导致对所有人群进行批量分析时，其对肿瘤分类的总体准确性较低（＜50%）；如果根据大小将EVPs分为3个亚群，肿瘤诊断的准确性可以提高到70%；进一步将EVPs 分组为大小间隔为10 nm 的亚群，并使用机器学习算法分析膜蛋白和EVPs 大小之间的相关性，发现其区分肿瘤类型的总体准确性可以提高到85%。该研究表明不同膜蛋白的选择与EVPs大小之间的相关性可能是临床肿瘤诊断有潜力的标志物。

1.4 其他

piRNAs是新型小沉默RNA，已被鉴定在癌症相关信号通路中发挥作用。2023年，RUI等［7］采用小RNA测序分析血清外泌体中的piRNAs，筛选出了253个差异表达的血清外泌体衍生的piRNAs，其中来自HCC的血清外泌体衍生的piRNAs 显示出独特的表达谱，说明外泌体中的piRNAs可能作为HCC诊断的生物标志物。TEPs 被认为是肿瘤生长的全身和局部反应的核心参与者。2023 年，CAMPOLO 等［8］在对胃肠胰神经内分泌肿瘤患者的TEPs 样本进行RNAseq 分析时鉴定出了差异表达的252 个circRNAs，首次证实了来自TEPs的circRNAs 特征可能是潜在的诊断和预测生物标志物。

2 液体活检标志物的临床应用

2.1 在肿瘤早期诊断和分期中的应用

早期诊断有助于提高肿瘤的治愈率和生存率，但是通过液体活检检测早期肿瘤仍具有一定挑战性，主要是因为缺乏针对早期病变的特异性生物标志物，而且相关标志物的水平可能很低。目前，肿瘤的早期诊断仍然是液体活检技术应用于临床的关键挑战，2023年，液体活检标志物研究在肿瘤的早期诊断方面取得了新的进展。BAE 等［9］对涵盖9 种癌症类型的2 125 个患者样本和1 241 个正常对照样本进行cfDNA 全基因组测序，并整合数据开发出新的诊断模型，结果显示，该模型对Ⅰ期肿瘤的敏感度高达98.2%，有可能实现超灵敏的早期肿瘤检测和准确的肿瘤组织起源定位。为提高肺癌早筛的准确性，SIKOSEK 等［10］前瞻性招募1 384 名符合肺癌筛查标准的个体，并收集全血进行超深度小RNA 测序，结果发现了18 个差异表达的小RNA，然后基于此建立诊断模型。该模型的诊断性能随肿瘤分期递增，从发现队列中Ⅰ期的0.73增加到Ⅳ期的0.90，验证队列中从Ⅰ期的0.76 增加到Ⅳ期的0.86［10］。这些数据表明，基于小RNA 的血液检测有可能成为低剂量计算机断层扫描筛查的可行替代方案，用于早期发现肺癌。

JO 等［11］利用原位高级别浆液性卵巢癌动物模型发现了基于EVs 的肿瘤标志物组合（包括EpCAM、CD24、VCAN、HE4和TNC），该组合可以将高级别浆液性卵巢癌与非肿瘤显著分开，敏感度为89%，特异度为93%。为提高外泌体检测的敏感度，YU 等［12］报道了一种纳米液体活检测定法，其通过双重特异性生物标志物抗原共识别和捕获策略，可检测低至78 pg/mL的胰腺癌外泌体特异性蛋白GPC1，而且具有较高的特异度和灵敏度，为早期胰腺癌的无创监测和诊断提供了可能。GUO 等［13］发现EVs 衍生的lncRNA GClnc1可有效区分早期胃癌与癌前病变（慢性萎缩性胃炎和肠上皮化生）以及传统胃肠道生物标志物（CEA、CA72-4 和CA19-9）阴性的胃癌，说明EVs 衍生的lncRNA GClnc1可能作为胃癌早期检测的循环生物标志物，为根治性手术和改善患者生存结局提供机会。

HCC 的早期诊断仍缺乏高度敏感和特异性的蛋白质生物标志物。XING 等［14］基于HABP2、CD163、AFP 和PIVKA-Ⅱ建立的诊断模型能够显著区分HCC 与肝硬化（AUC=0.979）和健康个体（AUC=0.992），优于现有的临床预测策略。该模型还可以准确预测肝硬化到HCC 的转化（AUC=0.890），而且比影像学诊断早11.4 个月。这些结果为液体活检技术用于临床提供了有价值的参考，也展现出了提高HCC 早期诊断水平的巨大潜力。XU 等［15］开发了一种基于血浆circRNAs 的生物标志物组合，可区分早期（Ⅰ/Ⅱ期）和晚期（Ⅲ/Ⅳ期）胰腺导管腺癌，与CA19-9 水平联合应用时，诊断性能显著提高（AUC=0.94），而且还能有效地识别CA19-9 阴性的胰腺导管腺癌患者（AUC=0.85）。

2.2 在肿瘤疗效评估和耐药性检测中的应用

监测液体活检标志物的动态变化有助于揭示肿瘤对治疗药物的耐药机制，从而指导临床医师选择合适的治疗方案。2023年，液体活检标志物在癌症治疗耐药性检测中的应用正在不断发展，包括在化疗、靶向治疗、免疫治疗等多种治疗方式的耐药性中的应用。

胃癌患者较高的治愈性切除率及良好预后与其对新辅助化疗（neo-adjuvant chemotherapy，NACT）的良好反应密切相关。2023 年，ZHANG 等［16］发现ctDNA 可作为预测Ⅱ～Ⅲ期胃癌患者预后和监测NACT反应的潜在生物标志物。该研究收集了接受2个周期NACT 胃癌患者的基线、NACT 后和手术后的血浆，使用包含425基因的panel检测ctDNA中的基因组改变（genomic alterations，GA）。该研究结果显示，临床Ⅲ期患者的ctDNA 浓度显著高于Ⅱ期患者；接受NACT 和手术后，ctDNA 的整体检出率逐渐降低；接受NACT后，最大变异等位基因频率（max-VAF）从0.50%下降到0.08%，GA数量从2.9下降到1.7；接受NACT后部分缓解的患者，max-VAF和GA数量也显著下降，但疾病进展患者则增加；在基线、NACT后或手术后可检测到ctDNA的患者总生存期较ctDNA检测不到的患者更差，且接受NACT前和接受NACT后ctDNA阴性的患者预后最好。

SAEKI 等［17］开发了一种基于SEPT9 甲基化的多重ddPCR技术，以对接受索拉非尼或仑伐替尼治疗的HCC 患者进行药物疗效筛查。该研究的多因素分析显示，甲基化SEPT9在验证队列中被确定为不良总生存期的预测因子，可能是分子靶向药物治疗HCC 患者的潜在疗效预测标志物。CARBONELL 等［18］对接受免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）治疗的转移性非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的血浆样本中的游离DNA 进行全基因组测序分析，计算肿瘤分数（tumor fraction，TFx）和体细胞拷贝数改变负荷，发现基线时的TFx 与骨骼和肝脏的转移性病变相关，高TFx 与ICIs 受益相关，且无论基线时的TFx 水平如何，其都能更好地预测治疗样本的临床疗效。

有研究使用仿生细胞滚动和树突分子偶联抗体技术纯化CTC，以检测头颈部鳞状细胞癌患者血液中CTC 的数量，发现随着放化疗和西妥昔单抗治疗的成功，CTC 数量明显下降［19］。KOJIC 等［20］开发了基于患者特异性体细胞突变的个性化ddPCR技术，该技术能够在每1 mL 脑脊液中检测到低至0.17 ng～85.39 ng ctDNA，用该技术对原发性和转移性小儿脑恶性肿瘤患者的脑脊液样本进行连续评估检测，发现ctDNA 水平与病程和临床疗效呈正相关。该研究说明基于个性化突变的液体活检在小儿脑恶性肿瘤疗效监测中的可行性。

化疗在转移性结直肠癌患者的治疗中仍然占主导地位，为预测患者对一线化疗的客观缓解率，YANG 等［21］收集了190 例在不同机构接受FOLFOX或XEOLX 化疗方案的转移性结直肠癌患者的血浆样本，通过进行血浆EVs 的RNA 测序，构建了由具有反映预测能力的22 个基于EVs 的RNA 组成的特征模型，结果显示，该模型能很好地将患者分为基于奥沙利铂的化疗敏感组和一线化疗前不敏感组，AUC值在训练队列、内部验证队列和外部验证队列中分别为0.986、0.821 和0.816。外泌体也可以通过递送miR-6836至顺铂敏感的上皮性卵巢癌细胞中，重建肿瘤微环境，逆转其对顺铂的反应［22］。胆管癌是一种预后不佳的异质性胆道恶性肿瘤。LAPITZ等［23］通过质谱法对不同患者血清EVs 进行高通量蛋白质组学分析，并基于机器学习的算法提出了具有预测预后能力的EVs 生物标志物组合，其中EVs 中的COMP/GNAI2/CFAI 高表达意味着胆管癌患者总生存期缩短，ACTN1/MYCT1/PF4V表达水平升高意味着总生存期延长，而且这两个合组合也可以对胆管癌患者进行预后分层，以增加有资格获得潜在治愈选择或接受更成功治疗的病例数量，从而降低胆管癌的死亡率。

2.3 在肿瘤预后评估、转移和复发监测中的应用

通过监测液体活检标志物的动态变化，可以预测肿瘤的复发转移风险和预后，从而指导临床医生及时采取必要的干预措施。ctDNA 是一种具有多方面作用的生物标志物，术前ctDNA 水平可反映早期肿瘤的复发风险，术后ctDNA 水平则可能预示肿瘤即将复发。ABBOSH 等［24］开发了一种系统发育追踪技术，该技术包括患者特异性锚定多重PCR 以及追踪肿瘤突变的ctDNA 富集，并结合信息工具用于低ctDNA 水平下对亚克隆结构进行非侵入性跟踪。该研究对197例早期NSCLC 患者术后120 d 内、辅助治疗或复发前连续收集的1 069 份血浆样本进行ctDNA 检测，结果在25%的术后患者中检测到ctDNA，包括49%的临床复发患者；确定了多克隆转移播散的患者与不良临床结局有关；通过测量术前血浆中的亚克隆癌细胞组分，发现与非转移性亚克隆相比，播种未来转移的亚克隆明显扩增。该研究结果表明ctDNA可用于检测和分析根治性治疗后持续存在的残留肿瘤细胞，使用ctDNA非侵入性检测的原发性肿瘤亚克隆扩增与转移潜力有关，在手术时预测后期转移复发的亚克隆组成可以为针对导致疾病复发的亚克隆的精准辅助治疗提供信息。

对ctDNA 甲基化的纵向评估有助于早期发现复发，优化患者的风险分层和术后治疗策略。一项多中心前瞻性纵向队列研究［25］从2 家医院招募350 例Ⅰ～Ⅲ期结直肠癌患者，在手术前和手术后、辅助化疗期间和术后收集血液样本，之后每3个月采集1 次（最多2 年），然后通过多重甲基化PCR 检测血浆样品中的ctDNA 的6 个DNA 甲基化标志物，以评估ctDNA 水平与结直肠癌在整个病程中复发的相关性。该研究发现，在296 例术前患者中，78.4%的患者6 种ctDNA 甲基化标志物中的任何一种检测呈阳性；术后1 个月，ctDNA 阳性患者的复发可能性是ctDNA 阴性患者的17.5 倍。该研究还显示，ctDNA 与癌胚抗原测试组合能显示复发风险分层，术后1 个月的ctDNA 状态也与接受不同持续时间和强度辅助化疗患者的预后密切相关；辅助化疗后，ctDNA阳性患者的无复发生存期明显短于ctDNA 阴性患者；根治性治疗后的纵向ctDNA分析显示，ctDNA 阳性患者的无复发生存期比ctDNA阴性患者差，且根治性治疗后通过ctDNA 分析发现的复发早于影像学证实的复发，中位提前期为3.3个月。

在复发前进行分子残留病灶生物标志物检测，尽早发现分子残留病灶并进行风险分层，有助于优化临床决策模式。CHEN 等［26］使用高效文库制备、增强的杂交捕获和基于UMI 的超深度靶向测序技术建立了一种先进的残留病灶检测技术。该技术基于对患者特异性肿瘤ctDNA 的检测，具有覆盖深度均匀、背景噪声低、准确定量、使用50 个突变标记和低至20 ng ctDNA 起始材料等优点，在针对早期NSCLC 患者的前瞻性研究中，可以帮助早期患者识别术后复发风险，监测临床复发后的治疗反应，为患者提供精确的分层，以便做出个性化的治疗决策。在血管免疫母细胞性T 细胞淋巴瘤中ctDNA 可作为液体活检的复发性突变和预后生物标志物，从而对患者进行分层并指导治疗选择［27］。有研究采用ddPCR 检测转移性胰腺导管腺癌患者ctDNA 样本中的NPTX2 甲基化程度，结果发现，诊断时较高的NPTX2 甲基化水平与不良预后相关，检测NPTX2 甲基化水平可以有效地对患者进行分层以预测总生存期，此外NPTX2 甲基化水平的动态变化也与疾病进展和治疗反应相关［28］。胰腺导管腺癌患者发生肝转移时血浆基因组中KRAS突变和max-VAF（variant allele fraction）的发生率均显著高于肺部、淋巴结、腹膜等其他部位转移患者［29］。

CD117 是卵巢干细胞常用的标志物，而EVs 中CD117的丰度与卵巢癌分级和治疗耐药状态相关［30］。对从卵巢癌腹水中分离的EVs 进行检测发现，复发性卵巢癌患者EVs 中CD117 的丰度远高于原发性肿瘤［30］。CTCs 和PD-L1 阳性EVs 组合可用于评估转移性NSCLC 患者预后［31］。尽管只有少部分的浸润性黏膜下结直肠癌（T1 期）患者存在淋巴结转移，但多数患者接受了淋巴结清扫术。为了准确地识别淋巴结转移阳性患者，防止过度治疗，MIYAZAKI 等［32］对200 例高危T1 期结直肠癌患者外泌体中的miRNA进行分析，发现4 种miRNA（miR-181b、miR-193b、miR-195 和miR-411）表达与患者淋巴结转移相关，进一步利用该组合建立风险分层模型，结果显示该模型将淋巴结转移的假阳性率降低了76%。基于血清8个miRNA的液体活志物组合也可用于预测胃癌患者术后1 年内发生早期复发的风险［33］。

3 液体活检标志物研究面临的挑战

分子生物学的技术进步引发了人们对研究液体活检作为肿瘤诊疗工具的兴趣，然而将液体活检应用于临床精准医疗仍然有一定局限性，主要包括以下方面：⑴液体活检标志物检测具有高度复杂性且准确性不高。一方面，受到不同器官来源的肿瘤脱落等因素的限制，液体活检标志物检测在泛癌筛查检测中的敏感度和特异度仍不高。另一方面，肿瘤异质性导致检测的复杂性，如组织学和血液学检测结果不一致、肿瘤进展的不同变化等。另外，具体的临床应用场景有不同的要求，如耐药突变检测需要更高的灵敏度，肿瘤突变载量的精确评估需要对主克隆和亚克隆进行全面检测，药物疗效的预测作用需要对ctDNA 清除率进行精确定义等，此外排除克隆性造血和其他背景噪声也很重要。⑵缺乏统一的液体活检标志物检测技术标准。目前，液体活检研究仍处于发展阶段，尚缺乏规范的操作程序和统一的数据分析方法，不同实验室的检测结果可能有较大异质，缺乏科学可比性，这在一定程度上影响其准确性和可靠性。此外，低浓度的CTCs 和ctDNA 会导致灵敏度降低，样品提取和处理过程中的污染可能导致假阳性和假阴性结果，复杂的检测过程和低效的设备也阻碍了其更广泛的应用。为提高其临床应用价值，在进行技术改进的同时，亟需建立液体活检标志物检测的标准化方法，包括采集容器的选择、抽血和血浆处理的使用时间和程序、液体活检成分提取/分离程序、准确稳定的库构建技术、强大的生物信息学分析平台和数据库等。⑶需要多维度和多组学的组合检测。越来越多的研究表明，单一类别的肿瘤标志物（如ctDNA 突变或DNA 甲基化）在敏感度和特异度方面存在明显的局限性，因此多维标志物和多组学的结合为液体活检在癌症中的应用提供了新的方向。多标志物组合分析可以更全面地了解肿瘤异质性，但是液体活检几种成分（可能来自不同的癌细胞群）的互补性仍有待进一步明确，可考虑将ctDNA 检测与甲基化、外泌体、循环miRNA、CTCs、代谢组学和分子成像方法相结合。另外，疾病的发生和发展涉及多个器官、细胞以及各种生物分子的相互作用，孤立的液体活检只能反映特定分子或生物标志物的水平，仍不能全面反映疾病的复杂特征。因此，有必要考虑整合其他检查技术，如CT、MRI 和超声检测。另外，目前大多数研究结果仍不能直接应用于临床实践，需要在更大的人群中进行严格的前瞻性试验和在临床应用前进行验证。

4 小结

综上所述，2023 年，液体活检标志物如ctDNA、CTCs、EVs 等在肿瘤早期诊断、疗效评估、预后预测、转移和复发监测等临床应用中都有了更加深入的研究和拓展。通过非侵入性程序获得的生物样本可以提供有关肿瘤各个方面的信息，有助于了解肿瘤发生和发展的分子机制，也有助于临床医师监测肿瘤的发生发展和评估治疗反应，从而为患者提供更准确和个性化的治疗决策。虽然目前仍存在一定局限性，但随着技术方法的不断进步和大规模临床试验的开展，许多生物标志物已经开始证明其价值，显示出了广阔的应用前景，相信液体活检将成为肿瘤诊断和治疗不可或缺的技术。