2023年度肿瘤甲基化标志物研究进展年终盘点

葛圣阳 李伟 于文强

作者单位：200433 上海 复旦大学生物医学研究院

癌症是全球死亡的主要原因之一，早期发现可以降低所有类型癌症的死亡率。因此，可靠的肿瘤筛查标志物研究和开发至关重要［1］。表观遗传修饰被定义为不涉及基础DNA 序列变化的遗传性基因活性变化，这些修饰通过表观遗传因素微调基因表达程序，是控制细胞分化、胚胎发育等关键生物过程的主要分子机制，并且强有力的证据表明表观遗传重编程是癌症动态转录组异质性的驱动力［2］。自首次在原发性人类肿瘤中识别出异常的DNA 甲基化以来，大量研究表明，DNA甲基化的变化在肿瘤进展和转移中扮演着重要的角色［3-5］。人类研究最为广泛的表观遗传修饰是DNA 甲基化，DNA 甲基化是发生在胞嘧啶核苷酸上的共价修饰，其中大部分发生在胞嘧啶后面跟着鸟嘌呤的位置（CpG位点），DNA 甲基化也可以通过连续的细胞分裂在没有DNA 甲基化维持的情况下被移除［6］。CpG 位点在基因组中并非随机分布，而是存在于CpG 岛等富含CG 的区域中，主要位于人类基因的调控区域［7］。CpG 岛的甲基化是一种转录抑制的表观遗传机制［8］。DNA 甲基化的变化在癌症早期就能出现，而且DNA 甲基化与癌细胞中大量的异常改变相关，基因启动子区域的超甲基化被认为具有致癌和影响预后作用［9］。所以，DNA 甲基化分析可有效识别具有临床意义的肿瘤甲基化标志物［10］。近年来，全基因组重亚硫酸盐测序（wholegenome bisulfite sequencing，WGBS）、甲基化敏感的限制酶测序（methylation-sensitive restriction enzyme sequencing，MRE-Seq）、简化的表观亚硫酸氢盐测序（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）等高通量技术的出现加速并扩展了人们对肿瘤发生的表观遗传机制的认识，揭示了大量具有潜在价值的癌症特异性表观遗传标记或特征，这些标记或特征可用于肿瘤诊断、预后预测或其对治疗的反应评估［11-13］。本文将探讨2023 年对临床肿瘤学产生重大科研影响的肿瘤甲基化标志物，主要根据样本来源对这些标志物进行细致分类，旨在通过深入分析表观遗传生物标志物的发现和研究，揭示其在未来临床实践中的潜在应用价值。

1 基于肿瘤组织检测的肿瘤甲基化标志物

1.1 消化系统肿瘤

由于DNA 甲基化发生在肿瘤发展的早期，有研究通过DNA 甲基化和基因表达的整合分析，并利用机器学习方法，揭示了胃腺癌潜在的诊断和预后甲基化特征标志［14］。该研究使用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）胃腺癌数据，识别出差异甲基化位点（differentially-methylated positions，DMPs）和差异表达基因（differentially-expressed genes，DEGs），在443 个肿瘤和27 个非肿瘤样本中，共识别出256 个DMPs，包括140 个高甲基化位点和116 个低甲基化位点；基因表达分析揭示了2 821 个DEGs，其中上调1 247 个，下调1 574 个；通过分析甲基化对基因表达的顺式和反式调控影响，观察到甲基化和表达之间主要是负相关，而在高甲基化和低甲基化基因中，分别与基因表达呈现负相关和正相关。为了寻找诊断生物标志物，该研究进一步使用了位于27个下调基因启动子中的28个高甲基化探针，通过实施特征选择方法选出8个探针，并基于此构建了一个诊断模型。该模型在训练队列和验证队列（GSE30601，包括203个肿瘤和94个非肿瘤样本）中的曲线下面积（area under the curve，AUC）分别达到0.99和0.97。在顺式调控的背景下，甲基化和基因表达之间普遍存在负相关［15］。HOSSEINI等［14］研究还观察到正常未甲基化的基因启动子CpG岛中DNA 甲基化异常增加和相关基因沉默是癌症中最明显的表观遗传改变，而在反式调控中，高甲基化基因主要与基因表达呈负相关。也有研究发现低甲基化基因更可能与基因表达呈正相关［16］。总之，这些研究为胃腺癌引入了具有潜在应用价值的诊断和预后DNA甲基化标志物，但是需要进一步验证。

在胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）和慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）的鉴别诊断上，目前临床手段并不能有效区别，因此可能产生严重的后果［17-18］。DNA 甲基化标志物提供了一种分子标记手段，可用于区分PDAC 和CP。有研究通过机器学习方法和高级整合方法，识别出了可用于区分PDAC 和CP 的潜在生物标志物组合——cg03306374（PRKCB）和cg15506157（KLRG2），在验证队列中AUC 达0.905，其中PRKCB的CpG 岛中6 个DNA 甲基化位点在组织和患者血浆cfDNA 中的AUC达到了1.00［19］。因此认为，这些DNA 甲基化标志物可能显著提高对疑似胰腺癌患者的诊断质量。

1.2 呼吸系统肿瘤

基于癌症相关甲基化信号的动态特征，DNA甲基化检测有望在经手术治疗的非小细胞肺癌患者中检测微小残留病灶（minimal residual disease，MRD）和用于术后随访［20］。有研究在基于甲基化的肺癌动态分析（methylation based dynamic analysis for lung cancer，MEDAL）的患者队列中，通过对匹配肿瘤、肿瘤邻近组织和纵向血液样本进行超深度靶向测序和亚硫酸氢盐测序分析，然后采用肿瘤相关的甲基化状态MRD（tumorinformed methylation-based MRD，timMRD）评估每个血液样本的甲基化状态，在MEDAL队列（n=195）进行生存分析并在独立队列DYNAMIC（n=36）中验证［21］。该研究结果显示，术后时间点timMRD评分较高的患者在MEDAL 队列中展现出较短的无病生存期（HR=3.08，95%CI：1.48～6.42；P=0.002），在独立的DYNAMIC 队列中也是如此（HR=2.80，95%CI：0.96～8.20，P=0.041）。该研究进一步进行多因素回归分析，发现术后timMRD评分是肺癌独立预后因素，而且与肿瘤相关的体细胞突变状态相比，timMRD 评分在术后随访中识别复发患者的性能更佳，包括临床Ⅰ期等肿瘤负担较低的患者以及在基线期循环肿瘤DNA（ctDNA）阴性状态的复发患者。该研究还发现，与ctDNA 突变预测的平均时间相比，timMRD 评分在复发前120 d的阴性预测值为97.2%。另一个研究肺癌术后ctDNA 动态变化的临床独立队列DYNAMIC（n=36）也得出类似结果［22］。这些基于外周血的动态甲基化分析研究，为术后癌症监测提供了一种很有前途的策略。

恶性胸膜间皮瘤是一种罕见的恶性肿瘤，主要由石棉暴露引起［23］。一项病例对照研究分析了恶性胸膜间皮瘤诊断前血液样本中的DNA 甲基化特征，其嵌套于欧洲癌症和营养前瞻性调查（European prospective investigation into cancer and nutrition，EPIC）队列，旨在确定与恶性胸膜间皮瘤相关的DNA 甲基化标志物［24］。在EPIC 队列中，该研究纳入了20 年随访期间发生恶性胸膜间皮瘤的135 例参与者的样本，以及135 名匹配的无癌症对照样本。在发现阶段，该研究选择了在入组后5 年内发生恶性胸膜间皮瘤的EPIC 参与者（n=36）和匹配的对照，然后通过10 倍交叉验证和相关分析筛选出9 个差异甲基化CpGs：cg25755428（MRI1）、cg20389709（KLF11）、cg23870316、cg13862711（LHX6）、cg06417478（HOOK2）、cg00667948、cg01879420（AMD1）、cg25317025（RPL17）和cg06205333（RAP1A）。该研究通过受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析显示，基于基线特征（年龄、性别等）以及9个相关CpGs构建的模型对恶性胸膜间皮瘤的发生具有更好的预测价值，且在5 年以上才诊断的患者中仍保持一定的性能（＜5年AUC为0.89，5～10年AUC为0.80，10年AUC为0.75，基线AUC范围：0.63～0.67）。该研究分析了作为非侵入性生物标志物的DNA 甲基化标志物在恶性胸膜间皮瘤病例诊断前血液样本中的变化，其应用可提高对高风险石棉暴露者的识别，从而采取更密集的监测，以早期识别肿瘤。

1.3 泌尿系统肿瘤

DNA 甲基化标志物高灵敏度的特征也使其成为指导前列腺癌检测的理想策略［25］。前列腺癌的患病率与多种因素相关，包括年龄、遗传和种族等［26］。表观遗传失调是原发性前列腺癌的特征［26-27］。随着治疗手段的进步，患者寿命得到延长，但原发性前列腺癌向罕见部位（如大脑）转移现象也日益增多［28］。一项研究在42 例前列腺癌大脑转移（prostate cancer brain metastases，PCBM）的患者（其中17 例有匹配的原发肿瘤）中进行DNA 甲基化分析，以观察原发性前列腺癌与PCBM 之间的表观遗传差异、表观遗传变化与突变背景之间的关联，以及与前列腺癌大脑转移相关的特定表观遗传变化，结果显示，前列腺癌大脑转移中的异常甲基化和突变背景与PRC2复合体活性相关，尤其在SPOP 突变型前列腺癌大脑转移中特别明显［29］。尽管前列腺癌大脑转移表现出CpG 岛高甲基化表型，但该研究也观察到了涉及神经活性配体-受体相互作用基因组和细胞黏附分子（如GABRB3、CLDN8和CLDN4）启动子的低甲基化，这表明原发肿瘤中的肿瘤细胞可能需要特定的重编程才能形成大脑转移。该研究有助于揭示前列腺癌大脑转移的DNA 甲基化概况以及前列腺癌大脑转移相关异常DNA甲基化的潜在机制和影响。

2 基于血液活检的肿瘤甲基化标志物

2.1 基于血液ctDNA的肿瘤甲基化标志物

近年来，甲状腺结节的发病率越来越高，因此对甲状腺恶性结节和良性结节进行准确分类尤为重要。然而，目前的甲状腺癌诊断方法，包括超声检查和细针穿刺活检等手段的准确率仍较低［30-31］。有研究开发了一种靶向DNA甲基化测序检测方法——甲状腺癌甲基化捕获（thyroid-cancer-methylation-capture，ThyMet），主要用于测量血液中甲状腺乳头状癌特异性DNA 甲基化标志物水平，旨在以非侵入性的手段对甲状腺乳头状癌进行分类［32］。该研究通过开发基于靶向甲基化测序的基因组合，训练了一个包含6个标志物的ThyMet分类器（classifier），这6个标志物分别是［ACTRT2（-231，544）和MMEL1（-142，073）］、［ACTRT2（-231，552）和MMEL1（-142，065）］、［RIN1（-519）］、［SLC4A10（-200，384）和TBR1（+7，947）］、［ETV5（-146，955）和DGKG（+106，170）］、［ETV5（-146，929）和DGKG（+106，196）］。该研究结果显示，与超声检查相比，ThyMet 对甲状腺乳头状癌与良性结节的鉴别具有更高的特异度（0.723vs0.625），AUC 为0.828。该研究还显示，ThyMet 和超声分级的组合分类器进一步提高了甲状腺乳头状癌血浆分类的准确性，AUC 提高到0.923，灵敏度达0.957，特异度为0.708。已有研究表明ThyMet和超声检查存在互补关系［33-34］。因此，未来通过结合ctDNA甲基化和超声检查，有可能更精确地鉴别甲状腺结节的良性、恶性性质，从而为临床治疗选择提供更有力的依据。

2.2 基于外周血单核细胞的肿瘤甲基化标志物

在结直肠癌研究中，国内学者XIE 等［35］报道了一种基于DNA 甲基化的外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）检测方法，其通过微阵列、焦磷酸测序和靶向双硫仑测序分析结直肠癌患者和健康对照组PBMC 的全基因组甲基化景观，发现了5 个可用于结直肠癌诊断的DNA 甲基化标志物（cg11754974、cg24906336、cg22678228、cg26026551和cg00227790）。该研究还特别针对早期结直肠癌建立了一种单管多重甲基化特异性定量PCR 检测方法（multiple methylation-specific quantitative PCR assay，multi-msqPCR），用于同时检测5 个DNA 甲基化标志物。multi-msqPCR 允许对少至0.1%的PBMC DNA 样本进行定量分析，并且比单分子检测具有更好的鉴别性能。然后，基于甲基化标志物和multi-msqPCR方法构建了一个结直肠癌诊断模型（colorectal cancer diagnostic model，CDM），该模型在早期结直肠癌中的诊断效能表现出色（AUC 为0.91，敏感度为81.18%，特异度为89.39%），相比传统肿瘤标志物CEA（AUC 为0.79）有所改进，此外CDM 还能很好地鉴别晚期腺瘤病例（AUC 为0.85，敏感度为63.04%）［35］。该研究进一步的随访数据表明，CDM 较目前临床已有的诊断方法至多提早2 年识别出患结直肠癌的潜在风险。LUO等［36］也观察到类似结果。

类似地，通过利用乳腺癌患者的PBMCs，也有研究鉴定出了4 个乳腺癌特异性DNA 甲基化标志物，分别是cg16652347、cg13828440、cg11754974 和cg18637238［37］。该研究也基于这4 个DNA 甲基化标志物开发了一种高效方便的多重甲基化特异性定量PCR 检测方法，在多中心队列中验证其诊断性能，发现其能区分早期乳腺癌患者和正常对照组，诊断AUC达0.940，敏感度及特异度分别为93.2%和90.4%，而且这种检测方法的性能超过了现有的临床诊断手段，特别是在检测早期和微小肿瘤方面。

3 基于粪便检测的肿瘤甲基化标志物

在粪便和血液活检中，新的DNA 甲基化生物标志物也被提出可用于早期检测结直肠癌和癌前病变。有研究分析了76 对结直肠癌及其邻近正常组织样本、348 个粪便样本和136 个血液样本，通过生物信息学数据库筛选并使用甲基化特异性定量PCR 方法鉴定结直肠癌的候选生物标志物，其中使用血液和粪便样本验证了候选生物标志物的甲基化水平，结果鉴定出两个结直肠癌候选CpG 位点生物标志物：cg13096260 和cg12993163，而且这两个生物标志物在使用血液样本时表现出一定程度的诊断性能（敏感度和特异度均在70%～80%之间），在粪便样本检测时对结直肠癌和结直肠高危腺瘤也表现出更好的诊断价值［38］。CROSS等［39］研究也得出类似结果。

4 基于尿液的肿瘤甲基化标志物

膀胱尿路上皮癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，基于尿液的表观遗传学标志物有望成为检测尿路上皮癌的可靠工具［40-41］。有研究利用尿沉渣构建用于检测膀胱癌的甲基化诊断模型，其中筛选了7 种甲基化生物标志物（包括PSMD14、AKAP13、ZNF184、cg16966315、NRN1、P14ARF和MEIS1），并通过纳入单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）位点来提高模型的诊断性能，然后采用三阶段分析方法构建模型并评价诊断性能［42］。在Ⅲ期试验中，该诊断模型在外部验证队列中获得了良好的区分度，总体AUC为0.935，灵敏度为0.864，特异度为0.895。此外，与传统细胞学和FISH相比，该模型具有更高的灵敏度和相当的特异度，可能作为检测膀胱癌的替代方法。

子宫内膜癌发病率正在上升，目前的诊断通常需要侵入性的组织活检［43］。在子宫内膜癌的筛查上，DNA 甲基化标志物提供了一种应用更简便的筛查方法。有研究比较了子宫内膜癌患者不同样本（包括尿液、宫颈阴道自采样本和临床采集的宫颈刮片标本）中的DNA 甲基化标志物的检测性能，从103例被诊断为Ⅰ-Ⅳ期子宫内膜癌的患者中收集了配对样本，并且居家采集了受试者的尿液和宫颈阴道自采样本，所有样本都使用甲基化特异性定量PCR测试9 个DNA 甲基化标志物（ADCYAP1、BHLHE22、CDH13、CDO1、GALR1、GHSR、HAND2、SST和ZIC1），且与317名健康对照组的非配对样本进行比较，结果发现3 种标志物组合（CDH13+GHSR+SST、CDO1+GHSR+ZIC1和CDH13+CDO1+ZIC1）在尿液、自采样本和刮片样本中表现出优异的子宫内膜癌诊断性能，AUC 分别为0.95（95%CI：0.92～0.98）、0.94（95%CI：0.90～0.97）和0.97（95%CI：0.96～0.99），敏感度范围在89%～93%之间，特异度在90%～92%之间；交叉验证后也获得了类似的检测性能，CDH13+GHSR+SST、CDO1+GHSR+ZIC1和CDH13+CDO1+ZIC1的AUC 分别为0.94（95%CI：0.90～0.98）、0.92（95%CI：0.87～0.97）、0.97（95%CI：0.95～0.99），而且对Ⅰ期子宫内膜癌的检测保持了出色的诊断性能［44］。

5 基于阴道分泌物的肿瘤甲基化标志物

目前，已有研究通过卫生棉条收集的阴道分泌物进行子宫内膜癌筛查，通过使用子宫内膜癌组织、良性子宫内膜组织和良性宫颈阴道组织的DNA 作为样本，根据ROC 鉴别度、甲基化水平在肿瘤和对照之间的变化倍数以及无背景CpG 甲基化选择候选差异甲基化区域［45］。该研究结果显示，以28 个甲基化DNA标志物构成的基因组合能较好地区分良性子宫内膜组织和良性宫颈阴道组织，其特异度为96%（95%CI：89%～99%），敏感度为76%（95%CI：66%～84%），AUC为0.88；在PBS/EDTA卫生棉条缓冲液中，其特异度为96%（95%CI：87%～99%），敏感度为82%（95%CI：70%～91%），AUC为0.91，说明在卫生棉条收集的阴道分泌物中，子宫内膜癌相关的差异甲基化区域具有较高的灵敏度和特异度，而且添加EDTA 的卫生棉条缓冲液提高了检测的灵敏度。因此，未来通过二代甲基化组测序技术、严格的筛选标准和独立的验证，将有助于筛选出更优异的候选甲基化DNA标志物［46］。

6 基于多组织来源的DNA甲基化泛癌标志物

目前这些特定于癌症类型的生物标志物的性能各不相同，而且由于生物样本采集的限制和高昂的成本，易感个体仍然不可能同时接受所有癌症的筛查。因此，如果能在早期阶段识别出一种对所有类型的癌症都有效的、单一的、强大的生物标志物，将是理想的手段。

为了更好地研究肿瘤发生和转移过程中细胞的表观遗传模式，有团队开发了一种独特的可用于全基因组DNA 甲基化检测的手段——导向定位测序（guide positioning sequencing，GPS），其可实现甲基化精准检测和胞嘧啶高覆盖率（96%）［47］。GPS 的高覆盖率提供了大量的DNA 甲基化信息，这使在以前研究不足的区域能以相当高的分辨率检查癌症甲基化谱。GPS 提供了一个强大的工具以研究癌症的同质性，而且简化了癌症研究，并有可能找到癌症发生和转移的普遍机制。在分析癌细胞系的GPS数据时，经常遇到一种独特的现象：在多种类型的癌症样本中，有许多区域似乎异常高甲基化。该现象目前已被验证为泛癌标志物（universal cancer only markers，UCOM）。根据TCGA数据库中来自17 种癌症的7 000 多个样本确定了第一个UCOM——HIST1H4F，它是一种在所有类型的癌症中高甲基化的组蛋白相关基因［48］。

UCOM 已被证明具有4 个主要特征：恶性肿瘤特有、全有或全无、癌症超早期检测、易于检测，这些特征使UCOM 能够超越当前生物标志物的功效［48-49］。目前，UCOM在多种癌症的诊断中表现出很强的潜力，已在肺癌（在所有肺癌样本中的检测特异度和敏感度分别为96.5%和87.0%，在肺鳞状细胞癌中分别为96.5%和85.4%，在小细胞肺癌中分别为96.5%和95.7%）、宫颈癌（敏感度和特异度分别为90.9%和90.4%）、子宫内膜癌（敏感度为80.65%，特异度为82.81%）、尿路上皮癌（敏感度为86.7%，特异度为90.8%）等多种实体肿瘤中验证了其诊断效能［48-51］。

除了实体肿瘤组织，UCOM 还可以在多种来源样本中作为检测生物标志物，并且已经被证实具有较好的效果［1］。UCOM 对宫颈癌阴道分泌物样本的敏感度和特异度分别为90.9%和90.4%，当与高危人乳头状瘤病毒（human papilloma virus，HPV）检测或液基薄层细胞学检查（thin-prep cytology test，TCT）联合使用时，UCOM 对宫颈癌的敏感度和特异度分别提高到了95.7%和96.2%，特异度明显超过了单独的高危HPV检测（特异度为20.3%）、TCT（特异度为51.2%）和高危HPV与TCT联合检测（特异度为57.8%）［49］。使用尿液样本对尿路上皮癌进行检测的敏感度为86.7%，特异度为90.8%［51］。进一步通过改进的液体活检平台可将UCOM 与ctDNA一起用于检测罕见癌症［52］。此外，UCOM也在治疗效果评估和复发监测中展现了潜力，可作为乳腺癌转移的预测因子［51］。

如上所述，尽管UCOM 应用在癌症早期诊断方面取得了不错的成绩，但仍存在许多未知数，例如需要进一步积极探索UCOM 为何普遍存在于癌症中，UCOM背后的表观遗传调控机制也值得进一步研究，这可能为癌症治疗提供新的方向。另一个主要兴趣在于将UCOM 的同质性状与组织独特的标志物相结合的范围，以期以相反的方式精确检测癌症痕迹和识别肿瘤组织起源。但是，有理由相信UCOM 可以成为预防癌症、检测癌症以及潜在消除癌症的理想工具。

7 小结

2023 年，DNA 甲基化标志物的研究给我们带来很多惊喜，基于DNA 甲基化发生在肿瘤超早期和离体后性质稳定等特性，各种早期诊断的工具蓬勃发展，检测的组织来源既有传统的实体肿瘤组织液，也有少量的血液，更有无创的体液检测，甚至“变废为宝”，利用废弃卫生棉条进行检测，这些无疑为我们展示了一种逐渐无创化的研发趋势。同时，DNA甲基化标志物的“标志”意义也不再局限于肿瘤的早期检测，还囊括了肿瘤术后的MRD检测、术后的随访监测等，展现了更多的临床意义。此外，目前不同研究团队的DNA甲基化标志物使用思路也各有千秋，从单一癌种使用复杂的标志物基因组合到单一癌种使用单一或几个标志物，甚至是单一标志物诊断多种癌种，这些研究说明DNA甲基化标志物在癌症诊断和基因表达调控研究等方面具有广泛的应用前景，有望为癌症早期诊断和研究带来革命性的变化。

目前表观遗传学的发展方兴未艾，DNA甲基化标志物的研究更是如火如荼，未来可能继续深入研究DNA甲基化的调控机制，探索不同DNA甲基化状态下肿瘤发生、发展和治疗耐药性等方面的差异。在技术层面上，需要不断开发新的DNA甲基化检测技术和方法，以提高DNA甲基化标志物检测的特异度和灵敏度。同时，也需要持续开发新型的机器学习和深度学习算法，并将其应用于新的DNA 甲基化数据以预测潜在的甲基化标志物，协助从复杂的生物医学数据中快速地识别和分析与DNA甲基化标志物相关的特征。目前，多学科团队之间的紧密协作也正在积极推动实验室成果向临床应用的转化，从而实现利用甲基化数据进行临床诊断和个体化治疗，借助表观遗传学方法改进癌症患者的临床治疗效果，为癌症患者带来福音。