2023年度肿瘤单细胞与空间多组学研究进展盘点

吕艺蓁 孙世权，3

作者单位：710061 西安 1.西安交通大学公共卫生学院单细胞组学与健康研究中心；2.陕西省丝路区域地方病与健康促进协同创新中心；3.西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室

肿瘤是由环境与基因交互而形成的一种非传染性复杂疾病。世界卫生组织最新报道，癌症仍是全球主要的致死疾病之一［1］，且部分癌症新发病例数呈逐年上升趋势，严重危害了人民的生命健康，是当前重大的公共卫生问题。肿瘤的发生、发展与转归通常要经历（非必须）癌前病变演变为肿瘤，原位到转移扩散，干预后产生耐药性，康复与预后等过程［2］。在这些过程中常会涉及基因组、表观遗传组、转录组、蛋白质组和代谢组等多层面组学连续分子变化及调控［3］。在过去10 年里，单细胞与空间多组学技术在绘制肿瘤细胞图谱、解析肿瘤异质性、探究肿瘤微环境和临床应用等方面取得了重要突破。在2023 年度，单细胞与空间多组学创新技术曾多次被报道，如单细胞代谢组学被国际期刊Nature评为2023 年值得关注的7项技术之一［4］，单细胞组学与空间多组学技术则再次被NatureMethods杂志评为2023年度最值得关注技术之一［5］。在肿瘤应用方面，2023年肿瘤单细胞与空间多组学技术相关论文共发表3 586篇，相较于2022年的2 745篇及2021 年的2 006 篇，数量持续增加，可见肿瘤单细胞与空间多组学技术的研究热度仍处于迅速增长期，这一趋势不仅反映了单细胞与空间多组学技术在肿瘤研究中得到认可，也标志着新技术在揭示肿瘤发展复杂机制方面的重要性。本文针对2023 年度单细胞与空间多组学技术在肿瘤细胞图谱、肿瘤异质性、肿瘤微环境和临床应用与药物研发中的应用研究进展进行盘点与讨论。

1 肿瘤细胞图谱

人类肿瘤图谱网络（human tumor atlas network，HTAN）启动于2018年9月，这项研究计划从时间及空间方面在单细胞分辨率上对肿瘤发展过程进行阐述和总结，构建了单细胞多参数纵向网络图谱并将其与临床结果相结合，这有利于识别新的生物标志物以及疾病相关细胞类型、细胞状态和癌变过程的细胞相互作用，从而有助于肿瘤的预防和治疗［2］。2023 年11 月20 日发布的最新数据（4.1 版本）包括了来自21 个主要肿瘤部位的肿瘤样本，以及20 种不同类型的检测手段的组学数据［6］。

在2023 年度，泛癌细胞图谱研究依旧具有较高热度。自然杀伤（natural killer，NK）细胞在对抗肿瘤进展的免疫反应中发挥着重要作用。有研究纳入516例癌症患者涵盖24种癌症类型的NK 细胞单细胞转录组数据，系统刻画了泛癌细胞图谱中NK 细胞在不同癌症类型之间的共性与特性，发现了一群在肿瘤中特异性富集的NK 细胞群，其表现出抗肿瘤功能受损，且与不良预后和免疫治疗耐药性相关，显示了NK细胞亚群作为潜在治疗靶点的临床价值［7］。肿瘤浸润T 细胞是肿瘤免疫微环境的重要组成部分，且其抗肿瘤功效已被证实［8］，但其状态尚未完全确定。有研究通过绘制来自16 种癌症类型的308 048 个T 细胞的转录图谱，发现了一种以表达热休克蛋白基因等应激相关基因为特征的T 细胞应激反应状态（TSTR），这种细胞的高表达与免疫检查点阻断治疗无响应有关［9］。还有研究通过建立泛癌细胞图谱发现了41 个不同肿瘤的共有元程序，每一个元程序都由数10 个基因组成，这些基因在许多肿瘤的细胞亚群中协调上调，这一泛癌细胞图谱的构建为精准医学研究提供了新的思路［10］。此外，有研究建立了泛癌单细胞表观遗传和单细胞转录组图谱，揭示了不同癌症和正常组织的细胞类型，通过将肿瘤基因的表达与增强子的可及性相关联，评估了肿瘤基因的表观遗传调控［11］。

空间转录组技术与单细胞转录组数据的整合分析研究，可从空间维度构建肿瘤细胞图谱，有助于研究者更全面地了解肿瘤的发生、发展过程。有研究对31 例结直肠癌患者样本的免疫荧光、空间转录组及单细胞转录组进行分析，构建了结直肠癌演化的分子图谱，揭示了结直肠癌细胞的个体化生长轨迹［12］。另有研究通过将组织学与通过循环免疫荧光（cyclic immunofluorescence，CyCIF）获得的单细胞成像数据相结合，绘制了结直肠癌的二维图谱，并将二维图谱拼接重建三维图谱，这有助于更加深入理解有关正常组织和结直肠癌组织之间的差异以及肿瘤异质性等关键问题［13］。

2 肿瘤异质性

肿瘤异质性可分为肿瘤间异质性（intertumoral heterogeneity）和肿瘤内异质性（intratumor heterogeneity）。肿瘤内异质性源于肿瘤细胞间的遗传以及表观遗传等产生表型的差异，对肿瘤细胞耐药和癌症治疗研究至关重要［14］。即使是来自同一肿瘤的癌细胞，也可能在其基因组、转录组和蛋白质组水平上展现出细胞（表型）异质性。单细胞组学技术可用于研究细胞异质性（cellular heterogeneity），揭示瘤内细胞的遗传和表型差异，即细胞状态或细胞分群。同时，细胞并非游离存在于组织中，而是具有时空特异性。空间组学技术主要用于解析空间异质性（spatial heterogeneity）。但现有的空间组学技术在分辨率和基因水平通量上不能兼顾［15］。空间组学技术与单细胞组学联合分析为探索肿瘤异质性提供了一个多维度、全面的视角，因为通过整合分析，有望提高空间组学数据的分辨率。因此，通过单细胞与空间多组学技术研究肿瘤内异质性已成为当前癌症研究领域一大热点［16-18］。

在2023 年度，研究者针对肿瘤亚型的组织病理分层解析肿瘤异质性的不足，采用成像质谱流式细胞术（imaging mass cytometry，IMC）和单细胞转录组测序技术来表征416 例肺腺癌患者样本的肿瘤和免疫学景观，通过深度学习模型，仅用1 mm2大小的肿瘤就可以准确地预测患者术后病情进展［19］。众所周知，癌细胞转移是癌症死亡的主要原因，但是原发肿瘤与转移到靶器官肿瘤的差异性目前尚未明确。有研究利用单细胞转录组技术对结直肠癌肝脏转移或卵巢转移进行研究，发现一群PTPRO 和ASCL2 的干细胞样细胞群与肿瘤转移密切相关，这对阐明结直肠癌转移机制至关重要［20］。也有研究对原发性胰腺导管腺癌和肝转移的肿瘤细胞进行单细胞数据分析，发现CEACAM5/CEACAM6 导管细胞的积累与低生存率相关，提示其可能与促进肿瘤发展有关［16］。还有研究发现肌纤维母细胞的癌症相关成纤维细胞RGS5亚群可能在原发性胰腺导管腺癌转移中发挥关键作用［21］。此外，大量的肿瘤单细胞数据产生也对区分肿瘤细胞的恶性和非恶性提出了挑战。为此，有研究者开发了scATOMIC 工具，其在区分恶性和非恶性细胞以及预测转移性癌症的原发肿瘤来源方面有所帮助［22］。

3 肿瘤微环境

肿瘤内的异质性强调了细胞或细胞群的差异性，而肿瘤微环境则强调肿瘤发生、发展的系统性［23］。肿瘤微环境由免疫细胞、间质细胞、活性介质及肿瘤细胞组成，可分为免疫细胞为主的免疫微环境和成纤维细胞为主的非免疫微环境。单细胞与空间多组学技术为深入剖析肿瘤微环境中的细胞多样性和复杂性，明确肿瘤发生、发展及肿瘤逃逸机制等提供了新的途径［24-27］。

肿瘤免疫微环境中细胞之间的交互形成了肿瘤独特的生长环境，维持了肿瘤的生长并促成了肿瘤细胞的免疫逃逸。在2023 年度，有研究通过单细胞转录组数据对早期ER+乳腺癌连续活检中的肿瘤相关细胞群的“对话”形式进行研究，发现在癌细胞进化过程中肿瘤细胞通过上调多种细胞因子和生长因子，刺激巨噬细胞向免疫抑制表型分化，从而获得对治疗的耐药性［28］。另有研究通过对肺腺癌患者的肿瘤免疫微环境的空间特征进行分析，量化了细胞空间交互关系，表征了细胞之间的直接相互作用和通信模式，同时使用深度学习预测临床表征，以辅助术后治疗方案的制定［19］。肿瘤细胞的起源及随时间动态演化的过程一直是研究者们关注的问题，但限于当前技术，只能通过计算手段进行推测［29-30］。为了解决这一问题，有研究开发了一种捕获细胞动态的实证体内基因组技术Zman-seq，其主要用于估计肿瘤组织中不同免疫细胞亚群的丰度以及肿瘤微环境中免疫细胞状态的演化过程［31］。该技术在揭示肿瘤免疫微环境的复杂性以及免疫治疗反应方面发挥着重要作用。

肿瘤的形成不仅与免疫细胞有关，而且与非免疫细胞和细胞外基质的生态进化密切相关。一项对乳腺癌的研究通过整合单细胞数据与空间蛋白组数据，确定了9种成纤维细胞亚型和1类周细胞的标记基因及空间分布，辅助在不同研究中比较成纤维细胞亚型，以促进对其功能作用的分析［32］。也有研究通过分析多种常见癌症，绘制了成纤维细胞空间分布模式以及与肿瘤微环境错综复杂的细胞网络［33-34］，为开发新的治疗策略提供了思路。此外，肿瘤细胞与其他细胞之间的交流在肿瘤发生、恶化和转移中也发挥着不可替代的作用［35］。对于胰腺导管腺癌的恶性进展，有研究发现施万细胞（Schwann cell）通过Midkine 信号和白细胞介素-1α 促进胰腺导管腺癌和相关成纤维细胞向更恶性的亚型转化［36］。此外，2023年度有研究者发布了一种实验-数学方法，其将肿瘤微环境分解为相互作用的细胞类型相关小回路，通过识别小回路，可以简化肿瘤微环境的复杂性，从而更好地促进对肿瘤微环境的认识［37］。

病理切片是解读肿瘤微环境的传统方式，随着数字化病理技术的发展［38-39］，病理切片与单细胞组学数据的整合分析为解析复杂肿瘤微环境提供了一种新的思路。有研究通过对单细胞形态学和拓扑学进行建模分析，然后对肿瘤生态系统进行表征，揭示了人类乳腺癌生态系统细胞多样性及不同乳腺癌生态型之间的关联，这为了解乳腺癌提供了重要见解［40］。

4 在临床应用与药物研发中的应用

单细胞与空间多组学技术能准确获取单个细胞特有的信息表征，并针对体内的不同细胞类型及其分子机制进行深入研究，准确定位肿瘤标志物，发现有效药物靶点。单细胞与空间多组学技术已经广泛应用于肿瘤细胞克隆演化机制［12］、肿瘤分型［41］、新生物标志物鉴定［42］以及耐药性产生机制［43］等研究。对肿瘤患者进行单细胞测序图谱分析，可以确定不同分类患者（如疾病分期、分子分型）肿瘤微环境的差异，或有反应和无反应患者的差异，以更好地理解治疗的作用机制，并在此基础上开发针对性标志物以及新的治疗靶点［44］。

免疫疗法已经改变了许多肿瘤的治疗手段［45-48］，遗憾的是，这种治疗只对部分患者有效，而单细胞组学技术能发现用于预测患者对免疫疗法治疗效果和毒性反应的生物标志物［49-50］。免疫检查点分子在调节免疫激活与抑制的平衡中发挥关键作用，它们在正常生理状态下有助于自身耐受和免疫防御，但在肿瘤患者中，这些分子的表达增加会导致免疫逃逸。最新研究通过单细胞CRISPR筛选揭示了因果基因调控网络，发现了与细胞毒性T 细胞分化相关的检查点［51］。另有研究对接受免疫检查点阻断治疗的患者通过整合单细胞与空间转录组数据绘制T 细胞图谱，发现了一群以热休克蛋白高表达为特征的TSTR细胞，并推测其可能在免疫治疗抵抗中发挥重要作用［9］。

识别不同的刺激抗肿瘤免疫应答的方法对丰富免疫疗法工具库以及为患者提供更多和更有效的治疗选择也至关重要。为了能有效预测患者对免疫疗法的反应，提高抗肿瘤疗效，有研究通过对胶质母细胞瘤样本进行单细胞和空间转录组学分析，发现了一种与肿瘤相关的巨噬细胞亚群，该亚群高度表达免疫抑制SIGLEC9基因，并优先在抗PD-1 治疗无效的患者中聚集［52］。该研究进一步通过敲除SIGLEC9 在小鼠中的同源基因Siglece，发现可显著抑制肿瘤发展并延长生存期，此外敲除Siglece基因的小鼠与抗PD-1/PD-L1 疗法协同作用而有效减少了胶质母细胞瘤的生长，这一结果有望促进其免疫检查点阻滞疗法向更好和更安全的方向发展。

在药物研发方面，已有研究发现，即使在完全相同的癌细胞中，通过药物干预仍会有一部分细胞产生耐药［53］，因此耐药产生的具体过程仍有待研究。为此，研究人员开发了一种新的单细胞标记技术FateMap［54］。该研究发现从单个癌细胞衍生的细胞会产生在分子、形态和功能上不同类型的耐药性，从而导致了耐药类型的多样性。这为单细胞衍生的癌症细胞系和接受多种药物治疗后观察细胞中的耐药性提供了证据。

5 小结

近年来，单细胞与空间多组学技术的迅猛发展，为探索肿瘤生物学机制提供了更广阔的空间。相比于传统多组学数据，单细胞与空间多组学数据在解析肿瘤起源与肿瘤异质性、肿瘤微环境和药物研发与临床转化等方面具有不可替代的优势［55］。然而，早期单细胞与空间多组学技术在肿瘤方面的应用仍存在一些挑战。第一，单细胞与空间多组学数据获取成本高且受限制。一方面，实施这些高级技术可能涉及昂贵的仪器和设备，并需要大量资源。另一方面，该组学技术成熟度低、稳定性弱且较新的单细胞平台认可度不高，导致技术推广难度大、技术革新缓慢、数据获取成本居高不下。第二，肿瘤组织样本异质性高，但缺少规范化和标准化流程。由于肿瘤组织涉及全器官，不同组织的解离方案、新鲜组织单细胞悬液制备还是单细胞抽核等方案的选择问题，会因课题设计或课题目标不同而各异。不同的课题设计，组学数据和技术平台的选择也随之不同。例如，单细胞和空间转录组学非常适合在无偏细胞群体中进行全基因组分析，而单细胞蛋白质组学更适合于旨在对已知的分子靶点和细胞类型进行概要的研究。因此，如何规范课题设计是获取可信研究结果的关键。第三，单细胞与空间多组学数据处理难，但缺少有效的数据分析技术和规范。目前，已开发了众多用于单细胞与空间多组学数据分析的工具，如何选择适合课题设计的分析方法是获取可靠研究结果的基础［56］。在2023 年，针对以上3 方面的挑战，肿瘤单细胞与空间组学技术也有了突破性进展，这为将来深入探索肿瘤发生、发展，以及该技术的临床应用奠定坚实基础。

肿瘤单细胞与空间组学技术的快速迭代更新无疑为精准医学研究开辟了新的思路。在未来的研究中，该技术可能在癌症免疫疗法（CAR-T）、类器官肿瘤细胞异质性研究及类器官抗肿瘤药物筛选中发挥重要作用。尽管实现肿瘤防治的终极目标还有很长的路要走，但是我们坚信肿瘤单细胞和空间多组学技术的研究将是这一旅程中的重要加速器。