青海一例犊牛腹泻大肠杆菌分离鉴定与药敏试验讨论

陈立

为探究青海省犊牛腹泻的优质治疗方案，本次试验依据当地牛养殖场内的犊牛腹泻发病案例，收集患病犊牛新鲜粪便为病料，采取实验室细菌分离法将病料中的大肠杆菌分离出，并明确大肠杆菌的致病性。同时采取纸片扩散法对提取出的大肠杆菌实施药敏试验，筛选出对大肠杆菌表现敏感的药物。研究结果表明：在本次病例中共分离出大肠杆菌致病菌株15种，且不同的菌株对药物的敏感性不同。其中对恩诺沙星、头孢噻呋钠敏感率较高，分别为87%、80%，對链霉素、阿莫西林、四环素耐药性较高，为67%。因此，建议该养殖户在实施犊牛腹泻治疗时，可使用恩诺沙星及头孢噻呋钠交替轮换治疗，并对发病严重的犊牛群体加以辅助药剂治疗，减少犊牛腹泻治疗的盲目性，以提升治疗效果。

一、青海省犊牛腹泻发生现状

青海省作为养殖大省，牛羊养殖为当地牧民的重要经济来源。在牛养殖期间，犊牛腹泻属于一种较为常见的传染性疾病，致病因较为复杂，通常包含环境因素、饲料因素、自身免疫因素等。犊牛在出生之后，由于其自身的消化道系统发育不完善，对致病原的抗性差，当养殖环境不良、营养供应不足、初乳不足或无法吃上初乳的情况下，均会导致犊牛的肠胃消化功能异常，较易受各种致病原的侵染，出现腹泻病症。通过对青海省的犊牛腹泻的发生与流行特征调查，青海省犊牛腹泻发生率逐年提升，且发病后持续周期长，药物治疗效果不佳，并且犊牛腹泻病症在经过治疗后，无法达到痊愈的效果，常表现出周期性、顽固性的传播与流行。为更好的防治青海省犊牛腹泻疾病，降低其对犊牛养殖的影响，需加强对致病原的研究与调查，并采取致病原分离鉴定、药敏试验，分析出最佳的药物治疗方案，以期能够在犊牛腹泻发病之初，短时间内控制出病情的恶化与传播，减轻其对牛养殖产业的不良影响。

二、犊牛腹泻大肠杆菌病原分离鉴定与药敏试验

1、试验材料与方法

（1）病情分析

在青海省格尔木市的一个肉牛养殖场内，共有牛104头，其中犊牛21头。近半年，该养殖场内的犊牛群出现断断续续的腹泻症状，不同日龄的犊牛其表现出的临床症状具有一定的差异性，以日龄越小的犊牛发病症状更为严重。在发现犊牛感病后，养殖户将患病犊牛单独隔离给药治疗，使用药剂为青霉素、链霉素，两者交换使用，在初期具有较好的治疗效果，但是一直未能彻底治愈。在治疗期间，一旦对患病犊牛用药停止，腹泻病情就会反复，并且加重，犊牛单次发病周期普遍在1～2周。技术人员对腹泻犊牛的新鲜粪便进行收集，共收集12只犊牛排泄物，并将其送至当地兽医实验室进行病原学、药敏试验研究。

（2）试验方法

①大肠杆菌分离鉴定

分别将所收集的12头犊牛新鲜粪便进行病原学鉴定，采取革兰氏染色的方式对病料进行涂片染色镜检观察。将所收集的犊牛新鲜粪便样品分别采取常规琼脂平板、麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板接种试验，接种后将各种培养平板分别置于恒温37℃的培养箱内48h，培养结束后观察培养平板中的细菌生长情况、外观状态。将从犊牛粪便样品中分离得到的疑似菌落接种至肉汤培养基中，并观察肉汤培养基内的变化，持续18h。

②生化鉴定

将从犊牛粪便样品中分离得到的菌株纯培养物分别接种至生化鉴定管中，并将其置于恒温37℃的培养箱内22h，持续观察各个生化管中的变化。

③致病性试验

选择6只小白鼠实施致病性试验，采取随机分组，将其分别分为试验组、对照组，每株有3只小白鼠。试验组内的小白鼠单只腹腔内注射本次试验中分离得到的菌株纯培养物0.2mL；对照组小白鼠单只腹腔内注射无菌生理盐水0.2mL，单次注射。注射后，持续观察两组小白鼠的生存状态，从而分析该分离菌的致病性。

④药敏试验

采取纸片扩散法（K-B法），使用10种抗菌类药物对本次试验中所分离出的大肠杆菌执行药敏试验。药敏试验方法如下：使用实验室灭菌接种环从肉汤培养基中挑选出几个纯培养的大肠杆菌单菌落，并将其转移至装有无菌生理盐水的试管中，将菌悬液的浓度调整至0.5麦氏比浊单位。使用无菌的棉拭子蘸取菌悬液，涂抹接种至MH琼脂表面。使用实验室霉菌镊子取出不同抗菌类药剂的药敏纸片，均匀贴放在WH琼脂表面，并轻压纸片，使其接触密切。单个MH琼脂平板上贴药敏纸片5张，完成后将其置于37℃的恒温箱内培养观察18h后，取出MH琼脂平板测量各药敏纸片的抑菌圈直径范围，并判定大肠杆菌对不同抗菌药剂的敏感情况。参与本次药敏试验的药剂有阿莫西林、氨芐西林、头孢噻呋钠、氟苯尼考、四环素、庆大霉素、阿米卡星、链霉素、环丙沙星、恩诺沙星，判定标准以大肠杆菌ATCC25922为准。

纸片药物含量：阿莫西林20μg/片、氨芐西林10μg/片、头孢噻呋钠30μg/片、氟苯尼考30μg/片、四环素30μg/片、庆大霉素10μg/片、阿米卡星30μg/片、链霉素10μg/片、环丙沙星5μg/片、恩诺沙星10μg/片。

药敏抑菌圈直径判定标准；

阿莫西林：耐药（R）≤13mm、中介（I）14mm～17mm、敏感（S）≥18mm

氨芐西林：耐药（R）≤13mm、中介（I）14mm～16mm、敏感（S）≥17mm

头孢噻呋钠：耐药（R）≤17mm、中介（I）18mm～20mm、敏感（S）≥21mm

氟苯尼考：耐药（R）≤13mm、中介（I）14mm～17mm、敏感（S）≥18mm

四环素：耐药（R）≤11mm、中介（I）12mm～14mm、敏感（S）≥15mm

庆大霉素：耐药（R）≤12mm、中介（I）13mm～14mm、敏感（S）≥15mm

阿米卡星：耐药（R）≤14mm、中介（I）15mm～16mm、敏感（S）≥17mm

链霉素：耐药（R）≤11mm、中介（I）12mm～14mm、敏感（S）≥15mm

丙环沙星：耐药（R）≤15mm、中介（I）16mm～20mm、敏感（S）≥21mm

恩诺沙星：耐药（R）≤16mm、中介（I）17mm～22mm、敏感（S）≥23mm

2、结果与分析

（1）病原分离鉴定结果

对本次收集的患病犊牛新鲜粪便在常规营养琼脂平板上培养出中等、大型、圆形、中央较高、边缘较平整、潮湿平滑、灰色病原菌，直径为2～3mm，颜色半透明；在血液琼脂平板上培养出长势良好、菌落大小中等的菌落；在麦康凯琼脂平板上培养出大小中等、颜色粉红致病菌，且菌落边缘整齐，表现为水珠状；在伊红美蓝琼脂平板上培养出黑色、金属光泽的菌落群。

将上述分离得到的致病菌注入至常规肉汤培养基中，观察可见肉汤出现浑浊，且生成部分细小白色沉淀物。将培养平板内的致病菌经革兰氏染色后镜检观察，可见致病菌为中等大小的短棒状杆菌，菌体两端为钝圆形，多为单独或成对出现，无芽孢，有包膜，两级性染色表现较为显著。观察该病原分离鉴定结果，各临床特征符合大肠杆菌典型菌落特征，因此可判定该养殖场犊牛腹泻致病菌为大肠杆菌。

（2）生化鉴定结果

在本次试验中，共分离得到大肠杆菌不同菌株15株，通过生物化学鉴定结果表明，在本次试验中所提取出的大肠杆菌能够实现对葡萄糖、麦芽糖及乳糖的发酵，且在发酵的过程中，会产生酸及气体。在此15株大肠杆菌菌株中，部分不会对蔗糖进行发酵，且分离获取的大肠杆菌菌株也不会生成硫化氢、分解尿素、利用柠檬酸盐。在对大肠杆菌菌株实施硝酸还原试验期间，可见其硝酸还原试验结果为阳性，吲哚、甲基红阳性，VP试验阴性。分析以上本次试验的生物化学鉴别结果，可以判定该犊牛腹泻病例中分离出的菌株为大肠杆菌。

（3）动物致病性试验

将本次试验分离获取的菌株培养物接种至试验组小白鼠的体内，发现试验组的小白鼠均在完成接种后的24h内出现死亡，而对照组内的3只接种生理盐水的小白鼠并未出现死亡。试验组小白鼠在死亡前，临床表现为精神状态沉郁、毛发凌乱无光泽、尾部和腹部发绀、取食废绝、四肢僵硬，最终致死。对试验组致死小白鼠尸体进行剖检观察，可见此3只试验组小白鼠的肺脏组织有显著病变，分布多个出血点；肝脏、脾脏均有不同程度炎症表现，并且在病变位置有多个点状出血点，特别是小白鼠的肝周炎症表现，极为显著。采集小白鼠的病灶样品实施革兰氏染色镜检观察，可以发现有中等大小革兰氏染色阴性的短棒杆菌。对比从试验组死亡小白鼠体内脏器组织上分离得到的病原特征，与患病犊牛粪便样品中分离得到的病原基本一致，因此，可以判定从患病犊牛粪便样品内分离得到的大肠杆菌具有致病性。

（4）药敏试验结果分析

观察表1本次试验中大肠杆菌的药敏试验结果数据，可以发现，15个大肠杆菌菌株中，对恩诺沙星敏感株数最多，为13株，敏感率为87%；其次为头孢噻呋钠，敏感菌株数为12株，敏感率为80%；再次分别为氟苯尼考、环丙沙星，敏感菌株数均为10株，敏感率同为67%。对比耐药率，以阿莫西林、四环素、链霉素，耐药菌株数同为10株，耐药率为67%。

三、讨论分析

1、治疗措施

从本次犊牛腹泻大肠桿菌的分离鉴定与药敏试验研究结果可以发现，本次调查共在12头腹泻犊牛粪便中筛选出致病大肠杆菌15株，不同大肠杆菌菌株血清学有一定的差异性。且随着该株型存在时间的延长，部分菌株会对养殖场日常所使用的抗菌药物产生抗性，影响抗菌药物使用的治疗与控制效果。例如，在该养殖场内，养殖户在犊牛腹泻后，长期使用链霉素、青霉素进行交替用药控制犊牛腹泻。而在本次药敏试验中，大肠杆菌菌株对链霉素表现出敏感率为0%、耐药率为67%，证实持续使用该药剂对该养殖场内犊牛腹泻已经无较好治疗效果。

因此，当犊牛出现腹泻病症后，在实施临床药物治疗前，为保障治疗效果，应当先对致病原实施血清学鉴定，并开展相关的药敏试验，选择高敏感性药物进行针对性治疗。除此之外，在使用药物治疗前，应当注重轮换交替用药，不可长期使用同一种抗菌药剂持续给药治疗，同时切忌三种以上的抗菌药剂联合使用。在确定该犊牛腹泻是由大肠杆菌感染后引发的病症后，可结合药敏试验结果，选择适宜的药剂对该养殖场内的患病犊牛群体进行治疗给药。结合本次药敏试验的结果，可以发现以头孢噻呋钠及恩诺沙星药敏率最高，因此在治疗时，可采取该两种药剂的轮换交替使用。采取肌注治疗，头孢噻呋钠使用量为0.1mL/kg·bw、恩诺沙星使用量为0.2mL/kg·bw，每天给药2次，连续使用3d即可。在使用抗菌药物治疗犊牛腹泻的同时，可使用复方黄芪多糖注射液进行辅助治疗，以提升犊牛的抗病性，依照0.1mL/kg·bw进行肌注治疗，每天给药1次，连续使用5d。对于感病严重，出现酸中毒的犊牛群体，可使用5%葡萄糖生理盐水注射液500mL、12.5%维生素C 10mL、5%碳酸氢钠注射液100mL静脉注射治疗，每天使用1次，连续使用3d具有显著疗效。

在采取此药方治疗管理7d左右，患病犊牛基本恢复正常生长。对于部分治疗痊愈后，生长发育停滞、增肥率差的犊牛，采取淘汰处理，避免影响整体养殖效果。

2、预防管理措施

在基层牛养殖场内，由于养殖户自身对疫病的认识与防范力度不强，不重视牛群健康管理，使得犊牛腹泻的发病率增加。同时，养殖户在发现犊牛出现腹泻后，长期使用单一药剂治疗，促使致病原的耐药性提升，从而增加了大肠杆菌的侵染与繁殖，为该病的传播与蔓延打造了适宜的环境条件。因此，养殖户在开展牛群养殖期间，为避免致病原对牛群健康影响，应当加强实验室病原分离鉴定与药敏试验管理意识，做到早发现、早治疗，减少该病对养殖经济造成的不良影响。

除此之外，在犊牛养殖期间，为避免犊牛腹泻的发生与危害，养殖户还应当加强对犊牛的日常护理管理。日常加强对犊牛活动区域的卫生消毒，确保犊牛生活环境的洁净、卫生性。母牛在分娩期间，做好躯体、乳头、外阴等部位的全面消毒，可使用1%新洁尔灭溶液。犊牛在出生后及时断脐、取食充足初乳，提升免疫力水平。断奶犊牛喂养期间，注重饲料、饲草的洁净性，切勿喂养变质、被病菌污染的饲草、饲料，减少感病概率。同时，加强对牛舍温湿度的调控，将其控制在犊牛适宜的环境水平，加强通风，减少牛舍内的有毒气体含量。及时清理牛舍内犊牛排泄物、污染物，冲洗地面，牛舍保持干燥、洁净，减少牛舍内致病原基数。只有确保犊牛日常养护的科学性，提升犊牛机体抗病性、免疫能力，才能够保障犊牛腹泻的发生率及发生严重程度降低，维护犊牛良好生产性能。

综上所述，犊牛腹泻疾病在牛养殖期间属于一种较为常见的疾病，犊牛患病后表现出临床病症时间长、药物应用治疗效果较差的特征。犊牛在长期腹泻后，会出现体液的流失、酸中毒、体内电解质紊乱，严重造成犊牛死亡，影响牛养殖经济效益。并且，犊牛腹泻疾病具有传染性，一旦发病，将会蔓延感染其他健康犊牛，影响重大。为有效防控该疾病，养殖户应当加强对于犊牛群体的日常管理，确保犊牛生活环境适宜性。除此之外，当犊牛出现腹泻且难以治愈时，养殖户应当通过兽医实验室的病原分离鉴定及药敏试验研究，选择对大肠杆菌致病菌株高敏感类的药物，科学合理用药，提升治疗效果，降低菌株对药剂的抗性，将犊牛腹泻的发生与危害降至最低，保障犊牛养殖健康与经济效益。

（作者单位：816000青海省格尔木市唐古拉山镇兽医站）