玉米种子纯度快速分子检测技术及试验研究

王培珍 魏璇 蔺芳瑞 蔡俊琴 李洁

在保证种子质量的问题上，玉米种子是一个重要的代表。保证玉米种子的纯度和真实性是控制玉米种子质量的关键。同时，借助现代化新农业技术和基因鉴定技术鉴定玉米种子纯度也成了解决问题的核心。通过基因鉴定技术，可以快速准确地鉴定出玉米种子是否经过杂交，从而保证玉米种子的质量和产量。为了解决种子质量和耕地问题，需要加大监督和管理力度，同时加强技术研发和创新，推广现代化新农业技术和基因鉴定技术，提高农业生产效率和粮食安全保障能力。

种子是农业生产的基础，种子的质量直接影响到作物的产量和质量。优化种子检测技术是推动农业现代化发展的重要措施之一。种子的检查标准包括净度、发芽率、水分等，这些指标直接关系到种子的品质和生长能力，因此必须严格控制。同时，做好安全隔离、选取優质种子、规范制种流程、病虫害防治、父本管理和割除等工作也是提高种子的纯度、发芽率的重要手段。玉米种子是广泛应用的种子之一，控制玉米收获时间，做好晾晒、脱粒和运输工作，控制种子水分，标注种子名称等是保证玉米种子质量的重要步骤。在晾晒和脱粒过程中，要注意控制温度、湿度和通风，避免种子受到过度损伤。

一、影响玉米种子质量的因素

1、玉米种子的发芽率

玉米种子是农业生产中的重要作物之一，其种子的质量直接影响到作物的产量和品质。而种子的发芽率是衡量其质量的关键因素。根据质量标准要求，单粒播种子发芽率要求不低于92%。这也就意味着，如果玉米种子的发芽率低于这一标准，就会影响到种植后的播种效果。

2、玉米种子的品种纯度

首先，去杂不干净是种子纯度较差的主要原因之一。种子在收获后需要经过去杂处理，以保证种子的纯度。但是，如果去杂不干净，就会导致杂质残留在种子中，从而影响种子的品质。其次，隔离不安全也是导致种子纯度下降的原因之一。如果不同品种的玉米种植在相邻的地块上，就会发生杂交现象，这会影响玉米种子的纯度和品质。此外，种植方法不够规范也会影响种子的纯度。如果种植时不按照规范进行，比如种植密度过大或者过小，就会导致植株之间的竞争过度，从而影响种子的品质。去雄不及时也会直接影响玉米种子的纯度。

二、玉米种子纯度快速分子检测技术

1、机械视觉技术

机械视觉技术是一种包含了人工智能、神经生物学、自然科学、计算机技术、图片信息处理、模型认知等众多方面的高新技术。该技术主要利用计算机模仿人类视觉功能，从客观的图像中抓取视觉感觉信号，经过计算机进行信息处理、分析，用于试验测试、试验控制。机械视觉技术的发展取代了人工观察测量方式，改善了投放于市场的产品质量，同时获取大量信息，并对信息进行自动化处理，可用于设计信息、信息集成、信息加工等。因此，在自动化制造流程中，机械视觉技术可被广泛应用于工况监测、成品检测、品质管理等环节。

2、分子标记技术

深入理解分子标记技术的核心概念，首先需要明确分子标记的定义。在广义上，分子标记指的是可以遗传且能够被检测的DNA序列或蛋白质。而狭义上，分子标记特指那些能够反映出生物个体或群体基因组中特定差异的DNA片段。这些差异为我们提供了一种独特的方法，即通过检测和分析这些DNA序列或蛋白质，来了解生物体中单个DNA组的变异情况。分子标记技术便是基于这一原理而发展的，其主要目的是检测和分析DNA序列或蛋白质，进而揭示生物体中DNA组的变异。当前，这一领域主要包括两大技术路线：随机引物聚合酶链式反应标记技术和特异引物聚合酶链式标记技术。

随机引物聚合酶链式反应标记技术涉及随机选择单核苷酸序列作为实验对象。尽管该技术中检测脱氧核糖核酸的范围不够明确，但它能够在扩增的DNA范围内形成多态性分子变化。这些变化主要源自模板DNA的扩增范围差异，进而在实验结果的显性和隐性差异中，反映出不同实验基因组所在区域之间的扩增结果差异。与此同时，特异引物PCR标记技术则基于已知的DNA片段序列。它能够在常规的PCR重复温度下进行有效的扩增，并对特定DNA片段进行多态性研究。这种方法为我们提供了更为精确和可靠的方式来揭示生物体中DNA组的变异。

3、快速DNA提取方法

在传统的脱氧核糖核酸（DNA）提取方法中，种子芽或叶片常被用作实验材料。然而，这种方法存在许多不足，如技术复杂、耗时较长，且容易引发交叉感染，进而污染实验环境，对实验结果产生不良影响。为了克服这些局限性，本实验经过对多种快速DNA提取方法的收集和比较，最终选择应用多重PCR技术。多重PCR，也称为多重引物PCR，其核心是在标准的PCR反应体系中同时加入多对引物，用以扩增不同的DNA片段。从反应机理、试剂使用到操作过程，多重PCR都与传统的PCR技术相似。不过，与传统的DNA快速提取方法相比，多重PCR技术展现出显著的优势，其操作更为简便、高效，因而在脱氧核糖核酸检测领域得到了广泛的应用。

三、种子检测技术分析

1、田间检测

（1）分析玉米种子的特征

在农业生产中，玉米是一种重要的粮食作物，其生产过程中种子的质量至关重要。而玉米种子纯度的检测是保障种子质量不可或缺的一部分。在进行玉米种子纯度检测前，技术人员需要明确被检测玉米种子的特征，包括其品种、生长习性、生育特征等，并对相关资料进行全面收集、分析与整理。观察图片是一种重要的检测手段，通过研究种子的亲本来源，了解其种植位置、前作的生长情况等，可以更好地了解种子的品质和特征。这些信息的获取对于后期的田间管理具有重要意义，可以为玉米种植效果的保证奠定基础。

（2）采用正确的检测方法

在农业生产中，种子是农作物生产的关键环节之一。而为了保证种子的质量，就必须进行科学有效地检测。然而，检测方法的选择直接影响着检测效果，因此必须谨慎选择。为了保证种子的质量，选择科学有效的检测方法非常重要。不同的检测方法拥有不同的要求和标准，因此需要根据具体情况进行选择。在田间检测中，需要划定严格的检测区来保证检测的准确性。这样可以避免外来因素的干扰，保证检测结果的可靠性。为了保证检测区内的一致性，需要种植同一品种的作物，并保证种子来源一致。这样可以避免品种的差异对检测结果产生影响。为了保证检测结果的准确性，需要选择相同的地块，并采用相同的耕作制度、管理模式、栽培方法，控制影响玉米发育成长的因素。在对父本和母本进行检测时，需要运用科学的取点方法，如对角线式、阶梯式等，这样可以避免取样不均衡对检测结果产生影响。

（3）明确不同的检测时期

玉米是我国重要的农作物之一，其种子质量直接影响到作物的产量和品质。因此，在种子生产和质量检测过程中，对玉米种子的检测至关重要。而要做好玉米种子的检测工作，必须掌握最佳的检测时期，结合玉米的生长发育阶段，提高检测方法的科学性。玉米的生长发育阶段可以分为苗期、花期和成熟期，这几个时期的玉米种子表现最为突出，是种子检测的关键阶段。在不同的阶段，检测人员需要采取不同的检测方法和技术手段。在花期阶段，检测人员需要对玉米种子的母本和父本进行检测，以得出准确的母本杂株率、父本杂株率和母本散粉率。此外，还需要观察玉米的花色和主轴长度，对玉米植株的外在形态进行深入研究和综合判断，可以在花期加大检测频率，提高检测的准确率和可靠性。

2、种子纯度检测

玉米种子是农业生产中不可或缺的一部分，种子的纯度是影响作物产量的重要因素。室内检测是检测玉米种子纯度的常用方法，不需要完成周期性的种植活动，使检测更加方便高效。在实验室试验中，盐溶性蛋白凝胶电泳、形态检测和SSR分子标记检测是检测种子纯度的常用方法。其中，盐溶性蛋白质凝胶电泳检测方法需要根据回归方程进行操作，采用标准计算方法确定种子纯度合格率。形态检测方法需要对玉米种子的籽粒、幼苗和植株形态进行观察和检测，而SSR分子标记检测方法需要从玉米植株中提取脱氧核糖核酸，通过分离、扩增等方法进行排列，以比较植株之间的差异。随着现代生物鉴定技术的发展，各种新的种子纯度检测技术不断涌现。对于检测人员来说，选择科学有效的检测方法将更有利于提高作物的产量和质量。

四、玉米种子纯度快速分子检测技术应用

1、试验材料

玉米种子：100粒。缓冲液：0.5mol/LNaCl、100mol/LTris-HCL（pH值8.0）、50mol/LMEDTA、5%SDS、1%PVP（pH值8.0）、1×TE缓冲液（Tris-EDTA）、1×TBE（Tris-硼酸）缓冲液、5×TBE（Tris-硼酸）缓冲液、TEMED（四甲基乙二胺）、Acr-Bis（丙烯酰胺+甲叉丙烯酰胺复合液）、溴化乙锭（EB）。SDS法提取液：酚氯仿异戊醇溶液、氯仿异戊醇溶液、异丙醇溶液、乙醇溶液等。电泳试剂：1.2%琼脂糖、9%PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）。

2、试验设计

根据玉米种子纯度检测要求与快速分子检测技术功能对试验作出相应设计。此次试验主要使用DNA快速提取法、通用多重PCR技术。其中DNA快速提取法分为以下2种：一是参照CTAB法、SDS法提取试验样本；二是使用快速法提取试验样本DNA。完成DNA快速提取法后得出DNA浓度和完整性检测结果，使用通用多重PCR技术鉴定DNA因子并得出试验结果。

3、试验方法

（1）DNA快速提取法

①SDS法提取DNA。将样本磨碎后称取0.1g放入1.5mL的离心管中，加入1mL65℃DNA提取缓冲液后充分混合（缓冲液成分：0.5molNaCl、100molTris-HClpH值8.0、50molMEDTA、5%SDS、1%PVP）；室溫下（26℃），1000g离心10min，取上清1.5mL溶液加入等体积酚氯仿异戊醇后充分混合；室温下（26℃），1000g离心10min，取上清1.5mL溶液加入等体积氯仿异戊醇后充分混合；室温下（26℃），1000g离心10min，取上清1.5mL溶液加入等体积异丙醇后充分混合；室温下（26℃），1000g离心10min，取上清1.5mL溶液加入15μL70%乙醇清洗沉淀，清洗2次；晾干沉淀；加50μL1×TE缓冲液，溶解DNA后置于冷冻室保存，冷冻室温度为-20℃。

②CTAB法提取DNA，包括DNA完整性电泳检测与DNA质量PCR扩增检测。一是DNA完整性电泳检测。根据试验样本质量确定胶量，取1.2%琼脂糖，1×TBE作为溶剂，将溶液放置于微波炉中使其溶解后取出放凉。待溶液温度在60℃以下后加入适量EB，将胶倒至胶盒之中，待凝固后取出放入电泳槽；参照上述步骤进行浓度加样；用移液器将胶体加到样孔之中；接通电源，观察试验现象。二是DNA质量PCR扩增检测。从样本中筛选出多态性高、特异性好的样本，选取phi0.6用于检测。随后PCR扩增检测采用20μL扩增体系，其中上下游引物各0.5μL；用9%聚丙烯酰胺凝胶溶液检测PCR扩增产物。

（2）PAGE检测PCR扩增产物

完成DNA质量PCR扩增检测试验操作后需要使用PAGE检测样本PCR扩增产物，具体试验步骤如下：溶液配制（9%聚丙烯酰胺凝胶溶液），使用50mL蒸馏水、20mLTBE、30mL30%Acr-Bis、750μL10%过硫酸铵、75μL四甲基乙二胺；将配制完成的溶液灌入玻璃制胶板并观察是否有气泡产生，待溶液凝固后取出梳架，取出样孔内残留液体，待样孔干燥后放置于电泳槽上并注入1×TBE电极缓冲液；吸取2μL扩增产物于样孔内；用150V电泳稳压至凝胶底部；电泳结束后取出凝胶，放置于去离子水中清洗，清洗完成后加入AgNO3溶液并进行3min染色，染色完成后加入去离子水清洗，清洗完成后加入显影液，轻轻摇晃至条带清晰后即可进行清洗；完成清洗后进行读带，进而分析目标带情况。

4、试验结果

（1）提取液浓度及体积对DNA提取质量的影响

①对DNA完整性的影响。取10μL试验样本用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA的完整性，得出提取液浓度及体积对玉米种子DNA提取质量的影响结果。从体积梯度分析，200μL体积和400μL体积的试验样本均呈现出明显、清晰的主带效果，但是400μL的主带效果图弱于200μL主带效果。相比之前，600μL的样品主带效果更弱，但是仍能观察到部分成像。800、1000μL的样品主带效果几乎不明显。从浓度梯度分析，12个浓度梯度呈现“不明显—明显—不明显”的趋势，其中0.01mol/L浓度梯度的成像效果几乎不明显，0.2mol/L浓度梯度后的成像逐渐明显，0.05、0.06、0.07mol/L浓度梯度的成像效果最为明显。综合提取液浓度和体积的成像结果，0.05～0.07mol/L浓度梯度、200～600μL体积梯度为最佳提取液参数。

②对PCR产物的影响。取试验样本2μL行PCR扩增，用9%PAGE检测PCR扩增产物，验证提取液浓度和体积对玉米种子PCR产物的影响，得出试验结果效果。从浓度梯度分析，0.01、0.02mol/L的样品有较弱的目标带成像，0.03、0.04、0.05mol/L的样品有稍明显的目标带成像，0.06～0.20mol/L有明显的目标带成像。从体积梯度分析，200～1000μL溶液均有明显、清晰的目标带成像。因此，综合浓度梯度成像结果以及体积梯度成像结果得出，0.03～0.20mol/L的浓度梯度、200～1000μL体积梯度的溶液均满足PCR扩增要求。

（2）提取时间对DNA提取质量的影响

根据提取液浓度和体积对玉米种子DNA完整性和PCR产物的影响结果，采用最佳提取液浓度梯度和最佳体积梯度试验，使用0.05mol/L浓度梯度、500μL积梯度进行试验，在40、60、720、1440、2160、2880、4320min观察后混合提取液，得出试验结果成像。

①对DNA完整性的影响。取10μL试验样品用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测得出提取时间对DNA完整性有影响，得出提取时间对玉米种子DNA完整性的影响试验结果。1～20min的样品成像较弱且差异变化不明显；40min后亮度逐渐增加，各个梯度之间差异变化逐漸明显；60min后样品有明显、清晰的成像带；60～2880min样品差异变化不明显；4320min的样品成像呈发亮状态。因此，综合成像结果，为了确保玉米种子DNA完整性，将提取时间控制在1～2880min为佳。

②对PCR产物的影响。取2μL试验样品进行PCR扩增产物试验验证，用9%PAGE检测PCR扩增产物，研究提取时间对PCR产物的影响，得出提取时间对玉米种子PCR产物的影响试验结果。样品提取时间在1～2880min成像不明显，各个区间差异变化不显著；样品提取时间在4320min后呈现出的成像带亮度开始减弱，逐渐趋近于无光亮状态。因此，综合成像结果，提取时间在1～2880min的玉米种子样本均可满足PCR扩增要求。

玉米种子纯度快速分子检测技术中机械视觉技术、分子标记技术、DNA快速提取法分别能够应用于玉米种子外观观察、DNA序列标记、DNA检测，是快速检测玉米种子纯度的重要技术。此次试验主要综合DNA快速提取法和PCR扩增技术对玉米种子纯度进行检测，结合试验结果认为2种技术能够快速、有效验证玉米种子纯度。将2种技术综合应用于玉米种子纯度检测，能够有效提高玉米种子纯度鉴定效率，保障玉米种子真实性和纯度，助力农业生产、种业市场规范化、可持续发展。

（作者单位：1.015000 内蒙古巴彦淖尔市农畜产品质量安全中心；2.015000内蒙古巴彦淖尔市现代农牧事业发展中心）