小儿呼吸机相关肺炎与气道微生态关系的研究

刘艳 刘峰

医院获得性肺炎通常在入院48小时后发生，可分为呼吸机相关性肺炎 （ventilator associated pneumonia，VAP） 或非呼吸机相关性医院获得性肺炎 （NV-HAP），占医疗保健相关感染的25%。VAP指机械通气（mechanical ventilation，MV）开始48 h后至拔管后48 h时间段内发生的院内获得性肺炎［1］。有研究表明，VAP发生率为15%～60%，且病死率高达49%～70%［2］。国外早期VAP的平均发病率为9%～70%［3］。国内一项临床研究结果显示，我国VAP的发病率高达18%～60%，较高的发病率给患者的家庭以及社会造成极大的负担［4］。微生态是指共享人体内空间的共生、共栖病原微生物的生态共同体，包括细菌、古细菌、真菌和病毒等微生物。近年来随着分子生物学、生物信息学等技术方法的迅速发展，基因测序成本的下降和测序精度的提高，使得微生物组学研究逐步开展，越来越多学者认识到气道微生态在VAP发生发展过程中的重要作用［5］。因此本文就目前国内外关于小儿VAP与气道微生态方面的研究做一综述，以期为小儿VAP的治疗提供新思路。

1 气道微生物与肺炎的关系

研究发现，微生物与肺炎的复杂性和多样性有关，目前认为肺部优势菌属包括链球菌属（Streptococcus spp.）、普雷沃菌属（Prevotella spp.）、梭杆菌属（Fusobacteria spp.）和韦荣球菌属（Veillonella spp.），而嗜血杆菌属（Haemophilus spp.）和奈瑟菌属（Neisseria spp.）较少见［6］。肺炎可破坏气道和肺部微生物平衡，使得部分微生物快速浸润和增殖，导致机体生态失调，影响与宿主免疫状态密切相关的微生物群丰度、多样性和组成。

2 小儿VAP的特点

小儿鼻腔相对短小，后鼻道、气管、支气管狭窄，肺泡数量少，平滑肌发育不完善，呼吸深度有限，呼吸储备量较小，此外，气道黏膜娇嫩，血管含量丰富，易受病原菌侵袭，肺泡间质组织含量丰富，发生间质性肺炎、肺不张等疾病的风险增加，导致儿童VAP的发生率高［7］。虽然儿童的气道分泌物相对较少，但是由于免疫系统较弱，患儿更容易感染呼吸道病原体。而且小儿气道黏膜上皮分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，SIgA）水平含量低，肺泡巨噬细胞功能不足，这也是小儿易患VAP的重要原因之一［8］。预防VAP的方法包含非药物措施（如手卫生、口腔护理）、通气集束声门下分泌物的定位和引流、使用抗生素和益生菌等［9］。VAP通常发生机械通气超过48 h并接受有创手术的患者，特点为新发在放射学影像和症状上的肺浸润如发热，脓性分泌物，白细胞增多，氧合障碍，或缺氧加重。精确识别微生物对于后续干预和治疗至关重要。

3 小儿VAP的危险因素及与微生物的关系

与VAP相关的微生物的来源包括位于胃肠道或肺部系统的医疗设备（例如饲管、胃管和气管插管）、工作人员之间的微生物转移（缺乏足够的手部卫生）、宿主或治疗定植风险因素（例如抗生素、手术、潜在疾病严重程度、侵入性设备）和环境。细菌是VAP的主要原因。大多数 VAP 细菌病例是由革兰氏阴性菌引起的，只有 20%～ 30% 的病例是由革兰氏阳性菌引起的。耐多药 （multidrug-resistant，MDR） 细菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus，MRSA）在 VAP 中更常见。免疫抑制、抗生素使用和耐药性以及过去 3 个月内住院治疗是发生 MDR 感染的危险因素。对于插管患者，接受机械通气的时间越长，发生 MDR 感染的可能性就越大［10］。由于抗生素的广泛使用和医疗卫生水平差异，不同地区的VAP患儿呼吸道病原菌种类与耐药情况亦存在差异。革兰阴性菌是导致VAP的主要病原菌之一，其包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、克雷伯杆菌等［11］。这些细菌的耐药性普遍较高，治疗难度较大。革兰阳性菌也是VAP的常见病原菌［12］，如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、葡萄球菌等。这些细菌的耐药性相对较低，治疗相对容易。郝恒瑞等［13］的研究表明，肺炎克雷伯菌（29.09%）、鲍曼不动杆菌（21.82%）、铜绿假单胞菌（16.36%）是VAP常见的病原菌，部分早发型VAP患儿致病菌以金黄色葡萄球菌为主，晚发型VAP存在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等多药耐药菌交叉感染现象。近期国内研究发现，早发和晚发VAP患者的革兰阴性菌、阳性菌菌种、真菌及巨细胞病毒的检出率比较无明显差异［14］。儿童VAP经验性治疗VAP需了解其流行病学分布，结合当地药敏情况覆盖病原菌，同时需根据ICU常见细菌感染启动合理的经验性抗感染治疗才能提高VAP患者的存活率，如果病原菌检验结果及药敏试验提示经验性抗菌药物使用不合理，即使再根据结果调整亦不能改善患者预后［15］。

4 微生态研究技术

微生态研究技术包括传统方法和分子生物学方法。传统方法是通过培养微生物并观察其生长状态和特征来研究微生物群落的分布情况，但该方法存在一定的局限性，只能检测到可培养的菌种，无法反映微生物群落的整体情况。分子生物学方法则可以不依赖微生物的可培养性，通过特定的DNA序列或RNA序列来鉴定、定位和描述微生物群落的结构、组成及功能。主要的分子生物学方法包括聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）、实时荧光定量PCR、454测序、Illumina测序、Metagenomics等。由于微生物培养技术存在的局限性，许多种属相近的人体微生物无法通过传统的菌种培养鉴定方法区分，也无法反映微生物群落的动态变化。16S rRNA基因测序技术和全基因组测序目前应用最为广泛，但其本身也存在一定的局限性：①无法明确病毒和真菌在VAP患者气道的感染情况；②无法获得细菌功能代谢等有效信息；③基于一两个高变区的系统发育分析对部分种系的分辨效果不佳；④无法对特定菌种进行定量分析［16］。最近的研究利用16S核糖体RNA （rRNA）基因测序来深入研究微生物的代谢分类学，并分析健康和患病个体的细菌群落，甚至包括非典型微生物。在16S核糖体RNA （rRNA）基因测序中有两个关键指标：α多样性和β多样性，为了解肺部微生物群的组成和结构提供了关键的见解。在气管插管后仅48小时内即可检测到的α多样性减少与通气时间延长相关，但与VAP的发生或抗生素的使用不一定相关［17］。具体来说，在插管时，链球菌属、乳杆菌属和普雷沃菌属等类群在随后发生VAP的患者中丰度降低，而嗜血杆菌属、莫拉菌属、缓症链球菌/肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和产黑普雷沃菌属等类群在插管时更为普遍。微生物群落在调节生长、毒力、生物膜形成、群体感应和抗生素耐药性方面有着重要作用。β多样性受疾病存在和严重程度的影响，也可能影响肺部感染的易感性。气道生态失调在发生VAP的患者中比没有发生VAP的患者更明显，这可能与伯克霍尔德菌属、芽孢杆菌目（以金黄色葡萄球菌为主要种）和假单胞菌目等属的相对丰度有关［18］。检测细菌DNA并不能确认微生物的活性，因为DNA的存在可能由定植、排泄或非感染性的死亡微生物造成［19-24］。

5 气道微生态与VAP

气道微生态系统十分复杂，其对于呼吸系统正常功能的维持，以及呼吸系统疾病发生的影响一直是临床关注的热点。有研究发现，成人肺部菌群主要来自口咽，以厚壁菌门以及拟杆菌门为主构成，而儿童上呼吸道解剖结构与成人不同，且鼻咽部分泌物较多，因此其肺部菌群以来自鼻咽及口咽为主，主要为源自上呼吸道的莫拉菌属、葡萄菌属、链球菌属以及嗜血杆菌属等［25］。正常情况下，健康人体呼吸道可检测到丰富菌群共同维持呼吸道内环境稳态，构成呼吸道正常菌群，但当机体免疫力低下、定植菌致病力强、数量多时，发生气道微生态失衡，导致气道微生态发生改变。儿童成长期是呼吸道菌群发展的关键时期，遗传、分娩方式、喂养方式、生活环境、抗生素的使用等均可影响呼吸道菌群的组成［26-29］。同时，儿童上呼吸道发育不成熟，抵抗力较弱，其呼吸道细菌定植、增殖的风险更高，从而影响气道微生态平衡。

VAP是气道微生态的失调所致的结果之一。插管和呼吸机使用可以改变气道微生态，促进有害细菌如绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。这些病原体易于附着于下呼吸道的上皮细胞和呼吸道分泌物中形成生物膜，导致VAP的发生。维持气道微生态的平衡是预防和治疗VAP的目标之一。通过调整气道微生态，如使用益生菌、氧化剂和消毒剂等，可以减少病原体定植和生长，并增加有益菌种如乳酸菌的数量，从而减少VAP的风险。随着呼吸机在呼吸道疾病中的开展使用，越来越多的危重患儿得益于技术的发展存活率逐渐提高，但另一方面，MV的使用也带来了很多并发症，其中以VAP在临床上最为常见。MV为侵入性操作，破坏口咽部及呼吸道黏膜的正常屏障功能，可对患者气道菌群定植、病原清除造成不利影响。VAP不同于一般肺炎，其影响因素多且复杂。Abiramalatha等［30］在一项荟萃分析中明确指出，定期更换呼吸机回路能有效减少VAP发生率，侧面证实了气管导管气囊周围分泌物的滞留和下漏易使细菌进入支气管肺组织，增加VAP发生的危险。同时，接受MV治疗的患儿，自身疾病危重，需要反复使用多种抗菌药物，导致正常菌群的生长环境发生变化，增加条件致病菌和真菌感染的风险，这也是VAP难治的原因之一。Kelly等［31］指出VAP患者气道微生态的β多样性增加，即环境梯度不同生态群落之间组中组成的差异增加，抗生素的使用是造成菌群多样性降低的原因之一。Flanagan等［32］的临床研究结果显示，MV患者使用抗生素后气道上呼吸道菌群Shannon指数由1.48降低为0.59，铜绿假单胞菌成为优势菌群。Zakharkina等［33］使用16sRNA对MV患者气道样本测序，对物种多样性和丰度进行定量分析，结果显示，VAP患者假单胞杆菌的物种丰度高于未发生VAP的ICU患者，推测条件致病菌的丰度增加可一定程度推动VAP发生。Woo等［34］的研究发现，MV首次拔管成功患者Shannon指数在拔管后一周显著降低，而拔管失败患者Shannon指数则无明显变化，两组的β多样性比较差异有统计学意义，棒状杆菌及别嘌醇菌较高的丰度与28 d死亡率密切相关，提示呼吸微生物组动力学与MV拔管和短期死亡率有一定关联。患者气道微生态与VAP难治存在一定的关联性，对患者精确而及时气道微生态检测对于VAP的治疗非常重要。气道微生态的监测对预测和诊断VAP也很重要。通过对患者气道微生态进行定量和质量分析，可以提前识别有害菌株的存在，评估治疗效果，并引导治疗策略的制定。因此，气道微生态与VAP之间存在紧密的关系。通过了解和调整气道微生态，可以有效预防和治疗VAP。

6 气道微生物影响VAP的潜在机制

肺免疫系统包括肺上皮细胞、肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、固有淋巴细胞和细胞因子/趋化因子，它们启动免疫反应并维持肺内环境稳态。复杂的肺部微生物群落在调节免疫系统中起着至关重要的作用，建立了共生关系。虽然肺部微生物组与固有或适应性反应之间的联系尚不完全清楚，但它在健康和疾病中影响宿主的免疫反应［35］。肺部微生物组在固有免疫细胞中发挥着不同的作用。树突状细胞、抗原呈递细胞和处理细胞激活T细胞应答。肺微生物组的生态失调可以改变树突状细胞过程，增加刺激促炎细胞因子产生的细胞因子。肺部微生物群的改变也导致Th17和调节性T细胞的缺乏，而这些细胞调节内环境稳态，维持肺部免疫耐受。此外，模式识别受体（pattern recognition receptors， PRRs），如toll样受体（Toll-like receptors， TLRs）和NOD型受体（NOD-type receptors， NLRs），在宿主与微生物组的相互作用中发挥关键作用。细菌代谢产物和细菌代谢产物也可能导致气道炎症细胞因子水平的变化。肺微生物组和炎症之间的关系对于保护肺免受病原微生物的侵袭至关重要。然而，肺部微生物组的生态失调会导致炎症，而微生物组复杂性的降低会产生双向的炎症-生态失调循环。肺部微生物组和宿主免疫的相互作用是复杂的，是各种呼吸系统疾病发生或进展的基础。理解这些相互作用的潜在机制和后果对于更好地理解VAP等疾病期间宿主微生物群的相互作用至关重要。某些微生物，如变形菌门的微生物，可以引发过度或不适当的肺部炎症反应，促进组织损伤和疾病进展。由厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门等不同菌门引起的生态失调［36］。

7 通过气道微生物预防VAP发展的策略

已经有研究通过益生菌来调节肺部微生物群，以达到治疗呼吸系统疾病的目的。然而，目前针对VAP的临床试验较少，因此对呼吸道菌群的影响仍有待确定。最近的研究表明，肠道益生菌可能通过局部和全身效应降低VAP的发生率。它们有可能控制病原菌的生长，调节肠-肺轴中的细菌移位，降低呼吸道中的微生物负荷，改善胃肠屏障功能。此外，益生菌在下呼吸道具有免疫增强作用，可能通过调节微生物组成和代谢，改善宿主免疫应答。然而，Johnstone等的一项研究表明，使用益生菌不能降低VAP的风险［37］。目前还没有临床研究来评估“呼吸道益生菌”（即向下呼吸道注入或雾化的活微生物群）的作用。仍需要更大规模、设计良好的临床试验来进一步评估。

综上所述，微生态作为气道屏障的组成部分，对宿主的代谢、免疫功能等具有重要影响，可作为VAP等呼吸系统疾病诊断和治疗的潜在靶点。VAP是影响MV治疗成功与否的关键因素。高通量测序技术的发展为VAP的病原检测和精准治疗开辟了新的方向。VAP是重症监护病房常见的并发症，具有较高的发病率和死亡率。目前已有预防策略，包括通气集束和适当使用抗生素。由于基于传统培养的检测方法的局限性，确定引起VAP的微生物仍然具有挑战性。目前对于微生物群属间、微生物与宿主间的相互作用机制，微生物抑制治疗对人体的健康影响等问题有待进一步深入研究。