枸杞多糖抗衰老的研究进展

李毛毛 李洁华

细胞衰老是以永久性增殖停滞为显著特点的细胞应答[1],伴有细胞表型的改变,包括染色质重塑、促炎因子分泌、自噬受损、代谢重编程[2-4]。衰老和心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)、肿瘤、神经退行性疾病、DM等与年龄相关的健康问题密切相关。细胞衰老发生在自发性内源性应激和外源性应激下,包括癌基因激活和端粒缩短(复制性耗竭)、持续的DNA损伤[5],其中DNA损伤是引起衰老最重要的因素[6]。

枸杞是一种干燥成熟的宁夏特产植物,属于茄科,广泛分布于欧亚大陆、非洲、北美洲和南美洲的干旱至半干旱环境中,具有丰富的药用和食用功能[7]。枸杞富含多种功效成分,包含枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide,LBP)、生物碱、枸杞色素、黄酮、氨基酸等[8]。枸杞的主要功能成分是多糖,具体来说就是LBP[9],它具有抗衰老、抗氧化、抗癌、免疫调节、生殖保护和细胞保护活性[10]。近年来,LBP在抗衰老方面的作用愈加受到国内外学者的关注,众多研究深入探讨了LBP延缓衰老进展的分子机制。本文系统地介绍了枸杞中可以延缓衰老的活性成分LBP,以期在临床与预防保健中更好地应用LBP。

1 LBP的组成及提取

1.1 LBP的组成 多糖是一种高分子化合物,它由多个单糖分子连接而成,并广泛存在于动物细胞膜和植物细胞壁中。多糖作为高分子物质,其生物活性受到单糖组成和空间结构等因素的影响[11]。LBP成分复杂,高达95%的LBP由聚糖组成,包括葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖以及岩藻糖[12]。

1.2 LBP提取方法 多糖的结构、分子及理化性质会因萃取方法的不同而不同,所得到不同萃取物的生物活性也不尽相同,LBP有着两类提取方法:第一种是较为传统的提取方法,包括经典热水萃取法(hot water extraction,HWE)、酸碱溶液萃取法、酒精萃取、发酵萃取、酶解萃取;第二种是较为新型的萃取方法,包括微波辅助萃取法、超声辅助萃取和加压液体萃取[13]。HWE操作的简易性和低成本使其成为常用的多糖提取方法,然而,在提取过程中,过高的温度可能会导致多糖结构受损,影响其功能效用。发酵萃取设备简单,操作安全方便,不产生有毒废物,且其提取多糖的条件温和、高效、可持续。酶解萃取需要维持酶的最佳活性,在最佳温度及最适宜pH下进行反应。与HWE法提取多糖相比,新型萃取方法能够提高提取效率、缩短提取时间、减少溶剂的消耗,增加多糖产出率[14-16]。

2 LBP抗衰老机制

2.1 LBP通过减少内源性、外源性氧化DNA损伤来延缓衰老 DNA损伤可以分为两种:一种是由于生物体内部的自发性因素,例如活性氧(reactive oxygen species,ROS)和细胞代谢副产物等引起的内源性损伤;另一种是由外界环境如电离辐射、紫外线、致突变化学物质引起的外源性损伤[17-18]。细胞中ROS的主要来源之一为线粒体产生的大量氧自由基[19]。细胞内线粒体功能障碍或内质网应激可导致ROS产生[20],ROS超过一定量会导致细胞内氧化/抗氧化失衡,从而导致氧化应激增加和进一步的DNA损伤[21]。ROS水平可通过增强抗氧化酶的活性来消除,ROS过多时机体自身通过分泌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)等抗氧化因子对抗氧化应激,维持氧化和抗氧化之间的平衡状态。

核因子红系2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)是一种关键的氧化还原敏感转录因子,HO-1是其下游基因。在生理条件下,Nrf2在细胞质中与抑制剂环氧氯丙烷相关蛋白1(kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1,Keap1)结合。然而,当细胞受损时,Nrf2会与Keap1解离并转位到细胞核,从而触发下游HO-1表达。实验表明,LBP可通过Nrf2/HO-1通路缓解过氧化氢(H2O2)诱导的细胞损伤,表现为LBP提前处理可显著降低ROS和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的水平,有效地将显著降低的抗氧化酶SOD和CAT的活性恢复到正常水平,使细胞内氧化和抗氧化之间达到平衡,最终缓解氧化应激,进而延缓衰老[22-23]。

2.2 LBP通过调节细胞凋亡延缓衰老 激酶级联包括磷酸肌苷3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B (protein kinase B,Akt)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)。PI3K/Akt/mTOR信号通路是参与细胞转录、翻译、迁移、代谢、增殖和存活的核心级联,与细胞凋亡和自噬密切相关。该信号通路在激活时可以减弱自噬,抑制细胞凋亡,促进细胞周期。必需的凋亡相关蛋白包括裂解的Caspase-3、Caspase-3、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax)。实验表明,LBP可下调裂解Caspase-3/Caspase-3、LC3II/LC3I、Beclin-1,上调Bcl-2/Bax和p62表达,磷酸化PI3Ks、Akt和mTOR,减少凋亡细胞的数量[24]。

Bcl-2和bax是与凋亡密切相关的基因。Bcl-2是抑制凋亡的基因,bax是促进凋亡的基因。Bax过度表达导致bax/bax同源二聚体的形成,从而促进细胞死亡。Bcl-2过表达导致Bcl-2/bax异二聚体的形成,进而防止细胞死亡。因此,Bcl-2/bax比值决定了细胞是否接收到诱导凋亡的信号。实验表明,与H2O2一起孵育导致ARPE-19细胞中Bcl-2阳性表达显著降低,bax阳性表达升高,Bcl-2/bax比值显著降低,提示细胞凋亡增加。然而,在与H2O2孵育之前先用LBP处理H2O2,通过上调Bcl-2的表达和下调bax的表达,可显著提高Bcl-2/bax的比值,表明LBP可通过调节Bcl-2/bax的表达水平,进而控制细胞凋亡,延缓衰老[25]。

p53参与DNA修复、代谢途径控制和细胞衰老,其主要功能是诱导细胞凋亡和细胞周期停滞[26]。p21是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,可阻断细胞周期进程并参与转录、细胞凋亡和DNA损伤修复[27]。当DNA损伤导致的双链断裂未完全修复时,共济失调毛细血管扩张突变激酶(ataxia telangiectasia-mutated,ATM)与ATM和Rad3相关激酶(ATM-and rads-related,ATR)的激活触发p53的磷酸化,p53的磷酸化形式调节p21诱导的细胞周期停滞,随后触发细胞衰老或凋亡。实验表明,LBP通过抑制斑马鱼发育早期细胞死亡和凋亡,降低p53、p21和Bax基因的表达水平,增加Mdm2和TERT基因的表达,缓解斑马鱼衰老[28]。

2.3 LBP通过抑制内质网应激和自噬来延缓衰老 内质网是蛋白质折叠和加工的主要场所,当细胞受到干扰因素的刺激时,内质网应激反应将被激活以维持细胞稳态和功能[29]。但过度刺激会诱导凋亡转录因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表达并触发细胞凋亡。自噬是指所有类型的细胞内成分的溶酶体降解和再循环,它是一种高度选择性的细胞清除途径,与维持细胞和组织稳态有关[30]。自噬是细胞自我保护的一种机制,但大量证据也表明,自噬可以诱导细胞凋亡并增强细胞毒性[31]。内质网是最大的Ca2+贮存细胞器,内质网应激可导致细胞内Ca2+不平衡,LBP可改善细胞内Ca2+的失衡。实验表明,LBP一方面显著抑制PM2.5触发的细胞内ROS的增加,恢复SOD的活性,并降低细胞内MDA水平;另一方面LBP可抑制内质网应激-CHOP凋亡信号,抑制内质网应激反应,降低GRP78和CHOP的表达,减少PM2.5诱导的自噬标志蛋白LC3I向LC3II的转化,使PM2.5诱导的自噬体水平、细胞凋亡和毒性显著降低,进而延缓衰老[32]。

2.4 LBP的其他抗衰老机制 慢性炎症会通过分泌细胞因子,促进炎症、重塑细胞外基质和不利地改变非衰老细胞的行为,加剧氧化损伤,诱导ROS、H2O2和羟基自由基的产生,加剧DNA损伤,加速衰老和相关疾病的发生[33]。LBP可以通过下调TLR4/NF-κB信号通路相关mRNA和蛋白的表达水平,减少促炎细胞因子IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α的产生来抑制炎症因子的释放,延缓衰老[34]。从LBP中进一步提纯可得到枸杞糖肽(lycium barbarum glycopeptide,LbGp),实验表明,LbGp 促进了FADS1和FADS2(FADS1、FADS2 是 二十二碳六烯酸产生的关键酶)的高mRNA表达,诱导小胶质细胞分泌二十二碳六烯酸,抑制 MAPK-NF-κB/焦亡相关通路,进而使得p-p-65、细胞凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1p45、Gasdermin D、GSDMD-N(裂解的Gasdermin D,一种细胞焦亡的执行因子)、NOD样受体蛋白-3(NOD-like receptor protein-3,NLRP3)、IL-1β以及IL-18蛋白表达降低,延缓衰老[35]。

转录因子DAF-16是人叉头盒O(forkhead box protein,OFOXO)的同源物,是胰岛素/胰岛素样生长因子(IGF-1)信号通路(insulin/IGF-1 signaling pathway,IIS)下游的关键效应因子,是氧化应激和衰老过程的主要下游调节因子之一,通过IIS影响秀丽隐杆线虫的衰老速度。实验表明,LbGp 可使DAF-16 靶基因(ctl-1、ctl-2、sod-2和sod-3)的转录水平显著增加。LbGp延缓衰老进展的作用通过调节IIS和生殖信号通路介导,进而激活应激反应转录因子DAF-16、热休克因子-1(heat shock factor,HSF-1)、热休克蛋白-16.2(heat shock protein-16.2,hsp-16.2)和SKN-1以及核受体DAF-12,从而触发下游长寿相关靶基因的表达以延长寿命[36-37]。

3 总结与展望

衰老是一个持续性的过程,发生在所有生命形式中。由于衰老细胞影响各种生理和病理过程,包括癌症和与年龄相关的疾病,积极探索抗衰老疗法具有重要意义。LBP作为传统中药枸杞的提取物,其主要通过以下机制延缓衰老:(1)通过增加抗氧化酶的表达,实现细胞内氧化与抗氧化的平衡,缓解ROS的过量产生,减少内源性DNA损伤,防止细胞周期停滞,改善衰老进程;(2)通过调节凋亡相关基因表达,减少凋亡细胞数量,控制衰老进程;(3)通过抑制内质网应激维持内质网内Ca2+水平和减少自噬来改善细胞衰老;(4)通过减少促炎因子的释放来调控衰老进展。本综述中的大多数研究仅评估了模式生物(如秀丽隐杆线虫、斑马鱼、小鼠)的寿命、抗氧化酶、炎症因子和衰老标志物水平。它们虽然在一定程度上与人类衰老状态相似,但不能完全复制LBP在人类体内抗衰老的作用方式。因此,为更好地将LBP应用于临床及预防保健中,仍需要大量体内外实验以及临床试验。体内研究不仅将证实衰老的相关生理,而且还将深入了解衰老是由诱导因子和靶细胞之间的相互作用直接诱导的,还是由其他细胞类型(例如巨噬细胞和小胶质细胞)间接介导的。此外,对LBP延缓衰老进展机制的研究也局限于相关途径、相关蛋白水平的变化,对其在衰老分子机制中的作用尚不明确。随着分离提取技术的逐渐进步,LBP又可进一步提纯出其他物质,关于这些物质的功效及作用机制目前研究较少。未来随着新技术的逐渐发展,关于LBP的研究将会进入新的阶段,其延缓衰老的作用机制也会更清晰明了,由此会探索出LBP更全面、系统地应用于延缓衰老进程、预防保健和改善年龄相关疾病进展中的具体方法,进而达到延长寿命、改善年龄相关疾病病人生存状态的目的。