基于网络药理学及分子对接探究金线莲降血脂的活性成分及作用机制

赵宏鹤，范方宇

（西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650224）

“网络靶标相关”的假说是由清华大学李梢教授于1999 年在中国科学技术协会第一次会议上提出。2007 年9 月，李梢教授发表了内容为“网络靶标研究框架：基于生物网络的方剂研究框架”的论文[1]。这一框架将传统的中药研究与现代的生物网络技术结合，从整体上探讨中药有效成分、作用机制和药物之间的联系，更好地阐述中药作用机理。同年10 月，英国药理学专家A L Hopkins[2]也提出了“网络药理学”这一概念，其对网络药理学的基本观点是：疾病是一种长期的、动态的、多靶点失衡所致的疾病，而单靶点药物只能调节单一疾病靶点，不能使疾病的多靶点被有效治疗，难以达到治疗效果，还可能造成不良毒副作用。相对中药而言，其理念为：多药物成分、多靶点、多通路，协作治疗，达到整体治疗目的。李梢教授指出，网络药理学是一门将多个生物学领域相结合，从系统、生物网络等层面，对药物与疾病之间的分子关系进行分析，并揭示其作用机理，是一门全局性药理学研究的新分支。

金线莲是我国闽浙台特有的民族中草药，具有清热解毒、凉血、润肺止咳等功效，民间常称为“金草”“神草”“药王”等。金线莲含有丰富的黄酮[3]、多糖[4]、甾体[5]等。近年来研究发现，金线莲的有效成分[6-7]可治疗肝炎、糖尿病、肿瘤等，同时具有降血压、降血脂的功效[8]，这也是金线莲作为药食两用食材的原因。闽浙台普遍认为金线莲具有预防、治疗“三高”作用，是一种以调节机体为主的药膳食材。金线莲常与土鸭、家兔、鸽子、排骨等一起煲汤，具有清凉、明目、保肝、凉血、滋肾益气等功效，深受人们喜爱。文献查阅发现，金线莲含有的多糖、金线莲苷、黄酮等物质具有降血脂作用。近年来，以金线莲作为原料的研究较多，但从网络药理学角度针对金线莲降血脂的研究未见报道。试验利用金线莲已知文献综述，结合网络药理学理论，构建成分-靶点-疾病的网络作用，分析金线莲降血脂机制，为开发金线莲降血脂的保健食品[9]提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 金线莲化学成分筛选

通过国内期刊、硕博论文数据库及PubMed、SCI 等数据库，以金线莲化学成分为研究对象，筛选金线莲化学成分。采用Pubchem 数据平台及化源网，并结合ChemDraw Professional 16.0 软件，对其化学结构进行绘制。将绘制好的分子结构输入Swiss ADME 数据库进行药物动力学筛选。检测报告中，以药代动力学（Pharmacokinetics）、类药性作为筛选条件（Druglikeness） [选择“肠胃道吸收为High”及5 个类药性（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）中2 个为“Yes”的化学物质] ，满足以上条件的化学物质作为金线莲降血脂的有效化学成分。

1.2 金线莲化学成分筛选及靶点预测

金线莲化学成分进行分析，并对其作用靶点进行预测。使用SwissTargetPrediction 平台对金线莲化学成分进行靶点预测。参数设置：选择人类（Homo sapiens），并输入SDF 格式的化学结构，点击运行，获取相应的化学成分靶点。

1.3 高血脂靶点的筛选

GeneCards 是一个包含了人类所有已被标注和预测的基因数据库。该数据库整合了全球150 多家与人类基因数据相关的网站，是一个综合性基因数据库。使用“Hyperlipidemia”作为关键词搜索数据库，以相关分数（Relevance score） ≥2 为筛选标准，并将其归类为高脂血症的靶点。

1.4 金线莲-高血脂交集靶点基因的获取

利用Venny2.1.0 在线网站，输入金线莲成分靶点及高血脂靶点，绘制金线莲与高血脂交集靶点韦恩图。交集靶点即为金线莲治疗高血脂的潜在靶点。

1.5 金线莲-活性成分-靶点-高血脂网络图的绘制

将金线莲化学成分、成分对应靶点与高血脂交集的靶点汇总后导入Cytoscape3.8.0 软件，依据这些靶点之间的对应关系，建立“金线莲-化学成分-交集靶点-高血脂”相互关联的网络图。通过对网络关系的调整，使药物-靶点-疾病三者之间的内在联系更为明确。

1.6 构建蛋白-疾病（PPI） 网络图

将金线莲化学成分与高脂血交集靶点输入STRING 数据库，物种设定为人类进行分析。预测结果去除非关联点，并将相互作用系数设置为0.4，获得关键靶点的互作图。互作图再导入Cytoscape3.8.0软件，以介数中心度数值进行绘制交集靶点互作（PPI） 网络图。互作网络图可以直观地了解生物体蛋白工作原理、疾病变化及蛋白间的功能关系，对于分析靶点相互作用具有重要的意义。

1.7 生物通路与功能富集

选定“Homo sapiens”，将交集靶点（成分与疾病交集靶点） 导入DAVID 数据库，根据GO 功能富集的BP（生物学过程）、CC（细胞组成）、MF（分子功能） 及KEGG-pathway 通路数据，绘制柱状图。在KEGG-PATHWAY 数据库输入KEGG-pathway 数据中相关性较高的通路名称，并使用KEGG Mapper工具绘制通路图并分析。

1.8 分子与疾病靶点对接

选取与蛋白质相互作用的前6 个靶点，分别输入PDB 数据库，下载相应3D 结构图。筛选出6 个核心靶点对应的金线莲化学成分，将化学成分输入Pubchem 数据库，下载2D 分子结构文件。将分子结构图录入MOE 建立小分子数据库，再将处理好的靶点蛋白与小分子数据库进行分子对接，对接次数设定为30 次，分子结构设定为10，其余参数默认。

2 结果与分析

2.1 金线莲化学成分筛选

通过检索有关文献，以“金线莲的化学成分”为关键字，获得128 种有效成分[10-12]。将128 个化学成分分别输入到Swiss ADME 数据库，以胃肠道吸收较好、类药性较好为筛选条件，最终选取了62 个化合物，并将其作为此次研究金线莲的化学成分。其中金线莲苷肠胃道吸收较低，但多篇文献报道其具有降血脂[13]功效，因此也被列为金线莲活性成分。

金线莲活性成分筛选见表1。

表1 金线莲活性成分筛选

2.2 金线莲活性成分作用靶点的筛选结果

将筛选后的62 个金线莲化学成分[14-16]输入到Swiss 靶点预测数据库，预测靶点。从数据库预测结果共得到2 469 个靶点，去重后获得645 个活性成分作用靶点。

2.3 高血脂靶点筛选结果

在GeneCards 数据库搜索“Hyperlipidemia”关键字，设定相关分数（Relevance score≥2），去除重复数据，获得了315 个与高脂血有关的靶点。

2.4 金线莲化学成分靶点- 高血脂交集靶点筛选结果

采用在线韦恩图软件，对金线莲和高血脂交集靶点韦恩图进行分析，结果显示高血脂有315 个靶点，约占靶点总数的34.3%；金线莲有645 个靶点，约占靶点总数的70.3%；其中金线莲- 高血脂交集靶点共有43 个，占全部作用靶标的4.7%。由图1 可知，金线莲化学成分[17-19]的作用靶点和高血脂交集靶点韦恩图表。

图1 金线莲化学成分靶点-高血脂靶点Venn 图

金线莲化学成分靶点- 高血脂靶点Venn 图见图1。

2.5 金线莲-活性成分-交集靶点-高血脂网络图

将金线莲与高血脂[20]共同交集的43 个靶点及对应的62 种活性成分导入Cytoscape 软件，并依据介数中心度数值大小绘制网络图（见图2），得到107 个节点，322 个连线。图2 中JLX 表示金线莲，圆形代表金线莲62 种活性成分，平行四边形代表交集靶点，GXZ 代表高血脂；CF58 亚麻酸、CF1 正十六烷酸、CF15 棕榈酸、CF4 2- 十二烷酮、CF40 3-O-β-D-葡萄糖基-（1-壬烯-7-醇） 为主要金线莲治疗高血脂主要化学成分。根据介数中心性大小，列出前6 个化学成分。

图2 金线莲-成分-靶点-高血脂网络图

金线莲- 成分- 靶点- 高血脂网络图见图2，金线莲化学成分介数中心性信息见表2。

表2 金线莲化学成分介数中心性信息

2.6 蛋白质-疾病相互作用（PPI） 和主要作用靶点的绘制

金线莲-高血脂交集靶点PPI 互作图（a） 及网络图（b） 见图3，交集靶点介数中心性信息见表3。

表3 交集靶点介数中心性信息

图3 金线莲-高血脂交集靶点PPI 互作图（a） 及网络图（b）

利用String 数据库，制作交集靶点（PPI） 互作图。下载cys 格式的互作图，并导入Cytoscape 3.8.0软件，按照介数中心性数值大小，绘制出靶点蛋白之间的网络图。在网络图中，图形越大，表示该靶点越重要；由图3（b） 可知，从蛋白质相互作用关系图中，选择了6 个介数中心度较高的交叉靶点。

2.7 KEGG Pathway 和GO 富集分析

金线莲-高血脂交集靶点GO 分析见图4，金线莲-高血脂交集靶点KEGG 通路富集分析见图5。

图4 金线莲-高血脂交集靶点GO 分析

图5 金线莲-高血脂交集靶点KEGG 通路富集分析

利用DAVID 数据库，导入金线莲化学成分与高血脂交集靶点。选取OFFICIAL-GENE-SYMBOL，物种选取人类，对其进行分析。分别下载GO-BP、GO-CC、GO-MF、KEGG-PATHWAY 数据，分别得到BP 通路147 条，17 个CC 过程，45 个MF 功能。将GO-BP、GO-CC、GO-MF 数据按降序排列，取前10 条数据进行汇总。将汇总后的数据输入微生信，进行GO 分析图绘制（图4）。从GO 分析图可以看出，GO 的含量与BP、CC 和MF 均相关，包括RNA聚合酶II 启动子的转录正调控、胞外空间，胞外基质，胞外的外来体，锌离子结合等都有一定的相关性。将KEGG_PATHWAY 数据按照降序排列，取前10 条数据，通过微生信作图工具绘制KEGG pathway气泡图（图5）。图5 中气泡颜色越深，-LogQ 值越大，相关性越大。金线莲主要通过Metabolic pathways、Pathways in cancer、Chemical carcinogenesis -receptor activation、PPAR signaling pathway、Transcriptional misregulation in cancer 发挥降血脂作用。通过KEGG 通路分析，富集在Metabolic pathways 的靶点有15 个，是所有通路中最多的。Metabolic pathways 代谢通路是金线莲化学成分主要发挥降血脂的通路，而癌症通路仅次于Metabolic pathways 代谢通路，也是金线莲主要发挥降血脂作用的通路，从信号图中可看出金线莲化学成分是通过作用于多通路、多靶点发挥降血脂的作用。

2.8 金线莲-高血脂分子对接

交集靶点与金线莲分子对接信息见表4，金线莲小分子与靶点蛋白分子对接信息见表5，金线莲与高血脂靶点最低结合能热图见图6，分子对接图见图7。

表4 交集靶点与金线莲分子对接信息

表5 金线莲小分子与靶点蛋白分子对接信息

图6 金线莲与高血脂靶点最低结合能热图

图7 分子对接图

从交集靶点PPI 互作图中，依据介数中心性（Betweenness Centrality） 降序排列，取靠前的6 个靶点作分子对接[21-22]。根据筛选好的6 个靶点蛋白，筛选对应金线莲化学成分，作为对接小分子。分别将靶点蛋白、小分子做前处理，对接靶点蛋白与对接小分子信息，利用MOE 软件，进行分子对接。将金线莲6 个化学成分与疾病6 个靶点蛋白进行分子对接，分子对接结果全部小于0 kcal/mol，可见金线莲的化学小分子配体能与受体蛋白可自发结合。取对接最低结合能作聚类热图，热图中横坐标代表靶点蛋白，纵坐标代表金线莲活性成分。图6 中黄色颜色越深，代表分子和靶点结合越好，其中CY3A4 与邻苯二甲酸二丁脂（Dibutyl Phthalate）、PPARA 邻苯二甲酸二丁脂（Dibutyl Phthalate）、PPARG 蛋白与亚麻酸（Linoelaidic acid）、VEGFA 与亚麻酸（Linoelaidic acid） 最低结合能平均值均在- 6 kcal/mol 以下，说明此4 种化学成分均能与高血脂靶点自由结合，说明配体和受体具有较强的结合活性[23]。选取热图中4 个与目标物结合得最好的小分子，进行分子对接，将其与目标物结合的区域进行放大，可以直观地展示目标物与目标物的结合。由图7 可知，在邻苯二甲酸二丁脂中，CY3A4 和ARG130 和SER134之间形成了2 个氢键，它们之间的距离为3.19，3.93；在PPARA 邻苯二甲酸二丁脂中，TYR334 和VAL332 2 个氨基酸残基之间距离为3.05、3.69，且存在着2 个氢键；PPARG 蛋白与亚麻酸上的GLY284 和LYS265 之间形成了2 个氢键，它们之间的距离为3.28、3.26；VEGFA 与亚麻酸中THR31 和LEU32 之间存在2 个氢键，两者之间的距离为2.92，2.94。

3 结论

经过研究发现，金线莲降血脂是通过多种活性成分作用于高血脂多种靶点，如正十六烷酸（正十六烷酸与棕榈酸互为同分异构体）、2-十二烷酮、亚麻酸、槲皮素-3,4'-二甲醚、山奈酚、槲皮素等化学成分。基于蛋白相互作用网络图及GO、KEGG 分析发现，金线莲降脂网络中含有多个与高脂血疾病相关的靶蛋白，包括IL-6、PPARA、PPARG、MMP9 等，多个靶蛋白协同调控高脂血症。PPARA是调控脂肪细胞分化和脂代谢的关键因子。激活的PPARA 能够与RXR 和DNA 上的过氧化酶体反应元件（PPRE） 相结合，从而促使细胞内与脂肪酸氧化有关的各种酶活化，促进细胞内脂肪酸异化，还对血清质有影响的载脂蛋白的表达有一定的调节效果[24]。MMP-9 主要是通过对基底膜进行降解，从而对单核细胞入侵起到了有利的作用，加快了氧化修改低密度脂蛋白的渗透速度，对平滑肌细胞的迁移和增殖起到了促进作用[25]。在KEGG-PATHWAY 通路中，有代谢通路（Metabolic pathways）、癌症通路（Pathways in cancer）、化学致癌- 受体激活通路（Chemical carcinogenesis - receptor activation）、过氧化物酶体增殖物激活受体α 通路（PPAR signaling pathway） 等信号通路，经查阅相关文献发现，这些靶点和通路均与高血脂相关。

通过挖掘数据与分子对接，初步证实了金线莲降血脂是利用多成分、多靶点、多通路协同治疗治疗高血脂，从而论证了民间食用金线莲来降低高血脂的经验。为深入研究其降血脂试验研究提供了基础。同时，也为金线莲制作保健产品提供了理论依据。