饼干中紫草红色素检测方法的建立

王 彬，何 冲，安 瑜，边文文

（陕西省产品质量监督检验研究院，陕西 西安 710048）

食品添加剂因具备增加食品风味、改善食品品质、提高食品营养价值等功能，被誉为现代食品工业魔法师[1]。紫草红是从紫草科紫草属植物根中提取的红色素，主要成分是紫草素及其衍生物，为暗紫红色结晶品、紫红色黏稠膏状或紫红色粉末，溶于有机溶剂和油脂，不溶于水，但溶于碱液[2-4]；可作为食品添加剂应用于饮料、饼干、果酒、肉制品、点心等食品中，天然健康，还具有清热消毒、消炎抗菌、防病抗癌等药理性功效[5-7]。紫草红色素因具性能稳定、色泽艳丽、吸附着色力强、持久力久等优点，在食品、保健品、药品、生物制品等领域有着广阔的应用前景。

在GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[8]中明确规定果汁饮料类、糕点、饼干、雪糕、果酒等食品中可添加的紫草红色素最大限量为0.1 g/kg。目前，食品色素产业发展迅猛，但关于检测紫草红色素的方法大多用于药品，而食品中检测方法尚未完善，检测方法滞后给食品安全带来了巨大的隐患[9]。梁占丽等人[10]建立了轨道阱高分辨质谱法，对饮料中紫草红进行了分析测定，检出限为200～500 μg/kg，相对标准偏差为4.0%～9.2%，可以简单快速地对饮料中紫草红色素进行快速筛选和分析。以食品作为基质的检测方法未见到相关的报道。通过对前处理方法进行摸索，优化色谱条件，建立高效液相色谱法测定饼干中紫草红色素的含量，为食品中紫草红色素安全监控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫草红标准品（20 mg），上海安谱实验科技股份有限公司提供；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯），赛默飞世尔科技有限公司提供；石油醚（分析纯），天津市富宇精细化工公司提供；无水乙醇（色谱纯），美国Honeywell 公司提供；甲酸（优级纯），天津市科密欧化学试剂公司提供；纤麸木糖醇消化饼干，东莞思朗食品有限公司提供。

1.2 仪器与设备

Waters E2695 型高效液相色谱仪，美国Waters公司产品；ST-16R 型高速离心机，美国ThermoFisher 公司产品；ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 色谱柱，美国Agilent 公司产品；AUTO 型全自动氮吹仪，厦门瑞科仪器有限公司产品；KQ-250DE 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；XS-20S 型电子分析天平，瑞士METTLER-TOLEDO 公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 紫草红标准溶液的配制

称取0.01 g 紫草红标品（精确至0.000 1 g），置于100 mL 容量瓶，用甲醇溶解，并定容，配制成质量浓度为100 μg/mL 紫草红标准溶液，于-18 ℃条件下避光保存。

1.3.2 样品前处理

称取饼干5 g（精确至0.01 g），加入20 mL 甲醇提取液，旋涡混匀，超声20 min，经过5 g 无水硫酸钠脱水后，以转速5 000 r/min 离心5 min，取上清于40 ℃条件下氮吹，甲醇- 0.1%甲酸= 85∶15（V/V） 流动相定容至1 mL，经0.22 μm PTFE 滤头过滤待测。

1.3.3 色谱条件

色谱柱采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A 为甲醇，B 为0.1%甲酸（V/V=85∶15），流速1.0 mL/min，检测波长516 nm，进样量10 μL，柱温35 ℃，采用等梯度洗脱。

1.3.4 标准曲线的测定

依次取适量标准溶液，稀释为0.5，1，2，5，10，50，100 μg/mL 7 个质量浓度梯度，以紫草红质量浓度为横坐标，峰面积平均值为纵坐标绘制紫草红标准曲线。

1.3.5 样品加标回收率测定

按上述前处理条件进行加标回收试验，在饼干中分别添加质量浓度为10.0，50.0，200.0 mg/kg 的紫草红标准溶液，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。

2 结果与分析

2.1 提取试剂的选择

食品中的紫草红常与其他人工合成色素混合使用，因此要去除人工合成色素的干扰。食用色素易溶于水，因此为了避免提取到食用色素，选用有机试剂进行提取。由图1 可知，以1.0 mg/kg 紫草红加标时，石油醚和无水乙醇作为提取剂时回收率较低，仅为31.25%和67.45%，乙腈回收率为81.21%，甲醇作为提取溶剂，相较乙腈提取回收率要更高，为100.32%。可见甲醇提取效果较好，虽带有一定的杂质，但对紫草红出峰情况影响不大，几乎不受人工合成色素的影响；且基线噪音小，峰形较美观，因此选择甲醇作为提取剂。

图1 不同提取剂对应的紫草红色素色谱图

不同提取剂对应的紫草红色素色谱图见图1，以饼干为基质4 种提取溶剂回收率比较见表1。

表1 以饼干为基质4 种提取溶剂回收率比较

由表1 可知，以甲醇提取剂时，噪音干扰小，基线平稳且回收率高，相对标准偏差在合适范围内。

2.2 提取方式选择

饼干通常含有巧克力、可可脂、乳化剂等物质，制样后添加物多的饼干不容易分散，直接浸提法提取效果不佳。试验对比超声不同时间的提取效果，选取时间分别为10，20，30，40 min。超声提取达到20 min 后，延长时间不能提高回收率。因此，确定了直接超声浸提为最佳紫草红色素提取方法，提取温度要严格控制在60 ℃以下，温度过高容易导致紫草素分解。

2.3 流动相及比例的选择

紫草素一般选择甲醇-缓冲盐体系和乙腈-甲酸作为流动相[11-12]，缓冲盐使用不当时易析出，因此试验测试乙腈-水和甲醇-水作为流动相时，紫草素峰形容易出现拖尾，峰较宽。流动相pH 值降低后，紫草素峰拖尾得到改善。

不同流动相下紫草红标准色谱图（50 μg/mL）见图2。

图2 不同流动相下紫草红标准色谱图（50 μg/mL）

由图2 可知，紫草红色素以乙腈-水为流动相时出峰时间较早且有些许拖尾现象，甲醇-0.1%甲酸为流动相时，峰不拖尾且对称；使用甲醇-0.1%甲酸时，优化比例后，紫草红出峰时间为5.273 min，峰形较好，可缩短分析时间，同时甲醇提取出来的杂质出峰较早，可与紫草红实现分离。

2.4 检测波长的选择

紫草红色素光谱图见图3。

图3 紫草红色素光谱图

由图3 可知，紫草素在217 nm 和516 nm 均有吸收，波长217 nm 下容易受其他杂质干扰，而516 nm下色谱图基线平整，干扰杂质相对较少且目标峰附近无杂质干扰峰，可较好地简化净化过程，因此确定检测波长为516 nm。

2.5 方法线性范围及检出限

紫草红色素的标准曲线见图4。

图4 紫草红色素的标准曲线

由图4 可知，质量浓度0.5～100.0 μg/mL 时表现出良好的线性关系。通过样品基线噪音在紫草红标准工作溶液的响应信号进行比较，以3 倍信噪比（S/N=3） 所对应样品中的紫草红质量浓度为检出限进行计算，得到方法检出限为0.2 mg/kg。

紫草红色素的线性范围、线性方程、相关系数、检出限见表2。

表2 紫草红色素的线性范围、线性方程、相关系数、检出限

2.6 回收率和精密度试验

加标回收试验结果表明，紫草红色素的平均回收率为88.1%～96.7%，相对标准偏差（RSD） 为2.7%～5.8%，表明该方法精确度高、准确性好，能够较准确地对饼干中紫草红色素进行定量测定。

饼干中紫草红色素回收率和精密度试验结果（n=6） 见表3。

表3 饼干中紫草红色素回收率和精密度试验结果（n=6）

2.7 实际饼干样品检测

采用该检测方法对市面上可能含有紫草红色素饼干进行检测，其中夹心饼干测出紫草红，威化饼干未检测出紫草红色素。相对标准偏差为2.2%～3.2%，结果表明该方法的精密度与重复性较好。

不同饼干样品中紫草红色素的测定结果（n=6）见表4。

表4 不同饼干样品中紫草红色素的测定结果（n=6）

3 结论

基于紫草红色素检测方法的滞后，建立了一种测定饼干中紫草红色素含量的高效液相色谱法。饼干样品经甲醇超声提取后定容上机，采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱，以甲醇- 0.1%甲酸=85∶15（V/V） 为流动相，检测波长为516 nm，柱温为35 ℃，采用等度洗脱。结果表明，在该色谱条件下紫草红色素质量浓度为0.5～100.0 μg/mL 时呈良好线性关系，相关系数大于0.999 9，方法检出限为0.2 mg/kg，平均加标回收率为88.1%～96.7%，相对标准偏差（n=6） 为2.7%～5.8%。表明该方法精确度高、准确性好，能够较准确地对饼干中紫草红色素进行定量测定。用此方法对5 种市销售饼干中紫草红色素含量进行测定，相对标准偏差为0.8%～3.2%，证实其具有前处理方法操作简单、分析时间短、加标回收率高、检测波长高、抗干扰能力强和检出限低的特点，可适用于饼干中的紫草红色素含量的检测。此方法的建立填补了紫草红在饼干食品中检测方法的空缺，为食品中紫草红色素的定量检测提供了理论参考。