两种酵母对葡萄酒挥发性物质的影响

陈佳富　熊丽娜　朱江润　付鸿博

摘 要：【目的】分析不同酵母對葡萄酒中挥发性物质的影响，并筛选适宜浓度。【方法】选择安琪活性葡萄酒专用酵母和大曲谷物酒酵母，将两种酵母分别设定3种浓度（100、150和200 mg/L）对葡萄进行发酵。采用顶空固相微萃取技术（HS-SPME）提取葡萄酒的挥发性物质，并用气相色谱-质谱联用（GC-MS）对其进行分析。【结果】所有处理中共有155种挥发性物质被鉴定，可将其分成9大类，包括烷烃类、烯烃类、醇类、酚类、醛类、酮类、酸类、酯类和其他类，其中酯类物质数量最多有42种；安琪酵母和大曲酵母发酵处理分别有117种和95种挥发性物质被鉴定到，无论是安琪酵母还是大曲酵母均是在200 mg/L时可鉴定到更多的挥发性物质；在6个处理中均能检测到的挥发性物质共有22种；利用安琪酵母发酵得到1种特异性物质为辛酸异戊酯，大曲酵母发酵后没有特异性物质；6个处理之间相比，每个处理之间均存在特异性物质。通过相对定量分析后发现，相对含量较高的为醇、酸和酯类物质，其中异戊醇为主要的醇类物质，乙酸乙酯为最主要的酯类物质。【结论】本研究为不同葡萄酒酿造过程中适宜酵母种类和浓度的选择提供了一定的参考依据。

关键词：安琪酵母；大曲酵母；葡萄酒；主成分分析；乙酸乙酯

文章编号：2096-8108（2024）03-0045-08 中图分类号：S663.1中图分类号 文献标识码：A文献标志码

Effects of Two Yeasts on Volatile Substances in Wine

CHEN  Jiafu1，2，XIONG  Lina1，ZHU  Jiangrun1，FU  Hongbo1*

（1.College of Biological and Agricultural Sciences， Honghe University， Key Laboratory for Research and Utilization of Characteristic Biological Resources in Southern Yunnan， Mengzi Yunnan 661199，China; 2.College of Horticulture Hunan Agricultural University， Changsha Hunan 410128，China）

Abstract： 【Objective】 The effects of different yeasts on volatile substances in wine were evaluated， and the appropriate concentration was screened.【Methods】Angel active wine yeast and Daqu grain wine yeast were selected， and three concentrations （ 100， 150 and 200 mg / L ） of each yeast were set for grape fermentation. The volatile substances of in grape fermentation were extracted by headspace solid phase microextraction （ HS-SPME ） and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （ GC-MS ）.【Results】A total of 155 volatile substances were identified in all treatments， which could be classified into nine types， including alkanes， alkenes， alcohols， phenols， aldehydes， ketones， acids， esters， and others， with the largest number of esters being 42. 117 and 95 volatile substances were identified by fermentation with Anqi yeast and Daqu yeast， respectively. Both Anqi yeast and Daqu yeast could identify more volatile substances at 200 mg/L. A total of 22 volatile substances were detected in 6 treatments. One specific volatile substance was obtained as isobutyl acetate using the fermentation of Anqi yeast compared with that of Daqu yeast， and no specific volatile substance was obtained after the fermentation of Daqu yeast. Compared between the six treatments， there were specific substances between each treatment. Through relative quantitative analysis， it was found that the relative contents of alcohols， acids and esters were higher， among which isoamyl alcohol was the main alcohol and ethyl acetate was the main ester. 【Conclusion】This study provided a reference for the selection of suitable yeast types and concentrations for different wine fermentation.

Keywords：anqi yeast; daqu yeast; wine; principal component analysis; ethyl acetate

葡萄（Vitis vinifera）作为一种古老的树种，栽培历史已有5 000年左右［1］。它也是世界上种植最早、分布最广、栽培面积最大的果树树种之一［2］。西班牙和意大利分别是世界上葡萄种植面积最大和葡萄酒生产最大的国家［3］。

在长期的栽培历史中，育种家通过不懈的努力，培育出大量葡萄新品种，目前，欧洲葡萄已有5 000多个品种，其果实除鲜食外，还可用作加工，制成葡萄酒或葡萄醋等［4-5］。葡萄成熟后落在地上，由于自然挤压和破碎，果汁和果皮接触到天然酵母后，开始发酵，这就是第1种葡萄酒的制作方法。葡萄酒因其令人陶醉的口感、优雅的香气和强烈的酸味，不仅能给人们带来愉悦的心情，而且对人类健康起着巨大的作用［6］。

发酵过程中所产生的挥发性物质是葡萄酒中主要的呈香物质［7］。葡萄酒发酵过程中产生的香气和风味的数量和质量取决于许多条件，例如环境、酿造过程和所选择发酵的酵母［8］。酵母是酿酒过程中的主要微生物［9］，自古以来，酵母就被用于生產酒精饮料，包括葡萄酒、啤酒和谷物酒［10］。作为人类使用的第1种微生物，酵母最早被记录为公元6 000年在埃及生产的布扎酸啤酒。目前，酵母已成为人类非常有用的微生物。其主要特点是，它能有效地将高浓度糖转化为醇类和感官［11］。作为一种重要的发酵产物，这些物质使酒精饮料散发出香味。这些香气的产生是各种酵母相互作用的结果，酵母多样性直接决定了葡萄酒风味和呈香［8］。由于酵母细胞壁的吸附能力不同，酵母会影响葡萄酒中的有益和有害物质［12］。酵母产生的胞外酶可能为葡萄酒提供其生产区域特有的特性［13］。酵母菌的代谢还产生大量的副产品，例如甘油、乙酸、琥珀酸和乳酸。此外，高级醇和其他挥发性物质的产生会严重影响葡萄酒的芳香特性。此外，作为一种活生物体，酵母含有多种酶系统，它们对葡萄酒质量起着重要作用［14］。

酵母是果品酿造的核心和关键，对果品酿造后的葡萄酒精度和色泽有很大影响。通过选择不同的酵母菌株并将其添加到发酵基质中，它们可以在基质中繁殖并引起酒精发酵，由此获得的葡萄酒发酵完全，无残留糖或低含量，酒精度略高，易于储存［4］。因此，选择能产生最受欢迎的香气和风味的酵母菌株对葡萄酒酿造非常重要。本研究选择不同浓度的安琪活性葡萄酒专用酵母和大曲谷物酒酵母对葡萄进行发酵，并对葡萄酒挥发性物质进行测定，分析酵母浓度和种类与葡萄酒挥发性物质之间的联系，对生产出具有目标消费者群体预期的风味和香气特征的葡萄酒具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 样品提取

试验所用材料为‘早黑宝葡萄，于2019年8月15日采自山西农业大学，将完全成熟的葡萄果实去梗，保留果皮，进行榨汁处理，得到葡萄汁。将葡萄汁转入发酵罐，在每个发酵罐中加入浓度为20 mg/L的SO2 （Na2SO3），混匀后在25 ℃下静置12 h，选择两种酵母，即安琪活性葡萄酒专用酵母（安琪酵母股份有限公司）和大曲谷物酒酵母（山西紫林醋业股份有限公司），将每种酵母分别设定为3种浓度（100、150和200 mg/L），在25～28 ℃发酵12 d，得到葡萄酒。分别采集20～30 mL葡萄酒样品。将每个样品以8 000×g离心10 min后收集5 mL上清液用于顶空固相微萃取（HS-SPME）提取。

1.2 挥发性物质测定

测定时间为2019年12月31日。顶空固相微萃取和气相色谱/质谱条件：首先，在40 ℃条件下，将DVB/CAR/PDMS萃取纤维头插入样品中吸附30 min；然后，将萃取纤维头置于GC入口处解吸5 min；随后，解吸完后自动进样进行GC-MS分析，其中GC-MS分析使用色谱柱（HP-5MS），进样口温度为280 ℃。加热过程中：初始温度＜40 ℃保持3 min，以5 ℃/min的速度升至180 ℃并保持1 min，随后以10 ℃/min的速度升至270 ℃并保持5 min。载气为高纯氦气，流量为1 mL/min，进气分流比为20∶1。

1.3 数据分析

数据分析、主成分分析和作图使用Microsoft Excel v. 2007、Statistical Analysis System v. 9.2和OriginPro 9.0进行。

2 结果与分析

2.1 葡萄酒挥发性物质类别分析

采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MC）分析了两种酵母在不同发酵浓度下葡萄酒样品的挥发性物质。葡萄酒中的挥发性物质共鉴定到155种，可将其分为9类（见表1），包括烷烃类、烯烃类、醇类、酚类、醛类、酮类、酸类、酯类和其他类。其中酯类物质鉴定到42种，数量最多，占总数量的27.10%，其次为烷烃类物质有28种。酚类物质数量最少鉴定到3种，只占总数量的0.02%。比较安琪酵母和大曲酵母发酵后对葡萄酒挥发性物质类别的数量影响可以发现，所鉴定的挥发性物质的数量有着明显差异。安琪酵母发酵后共鉴定出117种挥发性物质，明显高于大曲酵母发酵后鉴定出的95种挥发性物质，这种数量上的差异可能是由于用安琪酵母发酵可获得更多的酯类物质（35种），而用大曲酵母发酵鉴定到的酯类物质明显较少（23种）。用安琪酵母发酵后可获得更多数量的烷烃类、醇类、酚类、醛类、酸类、酯类和其他类物质，用大曲酵母可获得更多的烯烃类和酮类物质。两种酵母在浓度相同的情况下，安琪酵母发酵后所鉴定到的挥发性物质数量也明显高于大曲酵母。随着安琪酵母浓度的增加，挥发性物质的数量先减少后增加，浓度为200 mg/L时挥发性物质数量最多有71种，浓度为150 mg/L时挥发性物质数量最少有63种。大曲酵母则是随着酵母浓度的升高挥发性物质数量逐渐增加，当酵母浓度为200 mg/L时，可获得较多的挥发性物质（62种），当酵母浓度为100mg/L 时，挥发性物质数量较少（52种）。酵母的种类和浓度对葡萄酒中挥发性物质的数量有很大的影响。

2.2 葡萄酒挥发性物质相对含量分析

在用安琪酵母发酵条件下，醇、酸和酯类物质的相对含量较高（见表2）。其中，醇类物质含量在3个浓度安琪酵母发酵后均超过30%，随着浓度的升高，醇类物质含量表现为先升高后降低的趋势，在150 mg/L时，含量最高为35.26%；在200 mg/L时，含量最低为30.42%。酸类物质含量随着安琪酵母浓度的升高表现也表现为先升高后降低的趋势，在150 mg/L时，含量最高为31.58%；在100 mg/L时，含量最低为24.26%。酯类物质含量随着安琪酵母浓度的升高而降低，在100 mg/L时。含量最高为35.70%；在200 mg/L时，含量最低为24.81%。另外6类物质含量均较低，尤其是酚类和酮类物质均低于1%，当安琪酵母浓度为100 mg/L和150 mg/L时，没有检测到酚类物质。

在用大曲酵母发酵条件下，同样是醇、酸和酯类物质的相对含量较高（见表2），随着浓度的变化规律与安琪酵母发酵时存在差异。其中醇类和酯类物质含量在3个浓度大曲酵母发酵后均超过30%，醇类物质含量随着大曲酵母浓度的升高表现为逐渐降低的趋势，在100 mg/L時，含量最高为38.62%；在200 mg/L时，含量最低为30.04%。酯类物质含量随着大曲酵母浓度的升高表现为先降低后升高的趋势，在200 mg/L时，含量最高为40.63%；在150 mg/L时，含量最低为31.46%。酸类物质的含量随着大曲浓度表现为先升高后降低的趋势，在150 mg/L时，含量最高为32.99%；在100 mg/L时，含量最低为20.38%。另外6类物质含量均较低，其中酚类、醛类和酮类物质含量均低于1%，当大曲酵母浓度为100 mg/L时没有检测到酮类物质，当大曲酵母浓度为150 mg/L没有检测到酚类物质。

比较两种酵母在浓度相同的情况下挥发性物质相对含量可以发现，安琪酵母在3个浓度下所获得的烷烃类、烯烃类和其他类物质的含量均高于大曲酵母，大曲酵母在3个浓度下所获得的酯类物质的含量均高于安琪酵母。结合表1和表2综合分析可以发现，在两种酵母发酵条件下，酸类和醇类物质的数量均少于10种，但相对含量均较高，而烷烃类物质的数量均超过10种，但相对含量较低。安琪酵母在三个浓度下所鉴定到的酯类物质的数量均多于大曲酵母，但相对含量均低于大曲酵母。说明葡萄酒中的物质数量与相对含量无相关性。

2.3 不同酵母菌对葡萄酒挥发性物质的影响

将在葡萄酒中鉴定到的155种的挥发性物质以相对含量大于0.1为准则进行筛选，共获得42种主要的挥发性物质（见表3），包括烷烃类物质9种、烯烃类物质5种、醇类物质7种、醛类酚类酮类物质各1种、酸类物质4种、酯类物质11种和其他类物质3种。醇类的7种物质中，异戊醇的相对含量在6个处理中均最高，尤其是大曲酵母浓度为100 mg/L时，最高达38.14%。6个处理中当安琪酵母浓度为200 mg/L时，异戊醇含量最低（18.16 mg/L），但该处理下正戊醇含量较高为10.13%。酸类的4种物质中，含量最高的包括草酸和2-（氨基氧基）乙酸，其中草酸含量最高出现在安琪酵母（100 mg/L）、大曲酵母（100 mg/L）和大曲酵母（200 mg/L），且后2个处理没检测到2-（氨基氧基）乙酸。2-（氨基氧基）乙酸含量最高出现在安琪酵母（150 mg/L）、安琪酵母（200 mg/L）和大曲酵母（150 mg/L），同时这3个处理均没检测到草酸。酯类的11种物质中，乙酸乙酯的相对含量最高，是最重要的酯类物质。但两种酵母发酵后乙酸乙酯的含量差异较大，安琪酵母发酵后所获得的乙酸乙酯的相对含量要明显低于大曲酵母。尤其是安琪酵母浓度为150 mg/L和200 mg/L时，乙酸乙酯的含量均低于10%，这也直接影响了酯类物质总含量偏低（见表2）。

将所鉴定到的155种挥发性物质进行Venn图绘制（见图1）。结果表明：在6个处理中均能检测到的挥发性物质共有22种，其中烷烃类和酯类的数量较多分别为7种和5种。醇类和酯类物质中重要的异戊醇和乙酸乙酯两种物质也均在6个处理中鉴定到。安琪酵母和大曲酵母发酵后相比，利用安琪酵母发酵得到1种特异性物质为辛酸异戊酯，大曲酵母发酵后没有特异性物质。6个处理之间相比，每个处理之间均存在特异性物质，当安琪酵母浓度为100、150、200 mg/L和大曲酵母浓度为100、150、200 mg/L时分别得到的特异性物质有18、7、21、9、9和15种。当安琪酵母浓度为200 mg/L时所获得的特异性物质最多，其中酯类物质占比最大。

2.4 主成分分析

基于不同发酵条件的主成分分析结果确定了两个主成分，解释了葡萄酒中挥发性物质总变量的99.26% （见图1-a）。第一主成分占总变量的96.58%，与葡萄酒发酵处理具有较大的正相关值，表明这些处理对Prin1的贡献显著。第二主成分占总变量的2.68%。通过绘制主成分散点图（见图1-a）发现，第一主成分较大的为醇类，其次是酯类和酸类，但由于这3类物质的第二主成分差异较大，因此被明显分离。其他6类挥发性物质包括烷烃、烯烃、酮类、酚类、醛类和其他类，由于第一和第二主成分差异均较小，可分为一组。

基于不同挥发性物质类型的相对含量的主成分分析结果确定了两个主成分，解释了葡萄酒中挥发性物质总变量的94.14% （见图1-b）。第一主成分占总变量的77.23%，与酯类物质含量具有较大的负相关值，与酸类物质含量具有较大的正相关值。第二主成分占总变量的16.91%，与醇类物质具有较大的负相关值。通过绘制主成分散点图（见图1-b）发现，安琪酵母发酵后更容易获得相对含量更好的酸类物质，大曲酵母发酵后更容易获得相对含量较高的酯类物质。6个处理均被明显的分离，说明酵母种类和酵母浓度均对挥发性物质含量具有较大的影响。

3 讨论

本研究的目的是分析不同酵母对葡萄酒中挥发性物质的影响，并筛选适宜浓度。有关这一主题的文献表明，酵母菌种类以及每个种类中的不同菌株在挥发性物质方面有很大差异［15］。选用两种酵母QA23和OKAY发酵的3個品种干白葡萄酒中的主体香气成分浓度因酵母和葡萄品种的不同而有很大差异［8］。在不同菌株发酵赤霞珠干红葡萄酒酒样中共检出56种挥发性香气物质，其中SC酒样37种，PK1酒样41种，PK2酒样44种，PK3酒样39种，包括16种酯类、19种醇类、9种醛类、7种酸类、2种酮类和3种萜烯类，各混合发酵酒样组间除酸类物质之外，其他挥发性物质组成之间均存在显著差异［9］。选择ADT、CECA、NSD和VIC酵母发酵无核寒香蜜葡萄酒中分别检出39、39、28和26种挥发性物质［16］。因此，酵母引起的发酵香气是造成成分以及味道上的巨大差异的原因。本研究选择了两种酵母，分别为安琪活性葡萄酒专用酵母和大曲谷物酒酵母，安琪酵母被称为国产葡萄酒的新动力，1996年10月通过专家鉴定并迅速在全国诸多葡萄酒、果酒厂推广应用并且取得了良好的效果［17］。大曲谷物酒酵母属于酿酒酵母，目前将其在葡萄酒发酵中的研究较少。本研究结果表明用安琪酵母和大曲酵母发酵分别有117种和95种挥发性物质被鉴定到，其中均是酯类物质的数量较多，且比前人研究中所鉴定到的挥发性物质更多。两种酵母在浓度相同的情况下，安琪酵母发酵后所鉴定到的挥发性物质数量也明显高于大曲酵母。同时，随着安琪酵母浓度的增加，挥发性物质的数量先减少后增加，浓度为200 mg/L时挥发性物质数量最多；浓度为150 mg/L时挥发性物质数量。大曲酵母则是随着酵母浓度的升高挥发性物质数量逐渐增加，当酵母浓度为200 mg/L时，可获得较多的挥发性物质；当酵母浓度为100 mg/L时，挥发性物质数量较少。说明，酵母的种类和浓度对葡萄酒中挥发性物质的数量有很大的影响，安琪酵母与大曲酵母相比可获得更多数量的挥发性物质。

气相色谱-质谱法鉴定的大多数挥发性化合物对香气的呈现没有有效的贡献，只有少数挥发性化合物对特征性香气的呈现有显著的贡献［18］。因此，挥发性物质的类型和相对含量不能直接描述它们对风味的贡献程度，酯类是众所周知的花香和成熟果香的贡献者，酯类也是酒精发酵的典型副产品，并且是大多数酒精饮料，特别是葡萄酒的香气形成所必需的［19］。发酵香气产生令人愉快的水果味，主要成分是乙酸己酯、乙酸乙酯和乙酸异戊酯的混合物［20］。选择毕赤克鲁维酵母HSX-5、长孢洛德酵母MNS-6和戴尔有孢圆酵母YQX-8与酿酒酵母AWRI 796混合发酵赤霞珠葡萄酒的研究结果表明：相较于酿酒酵母单菌发酵酒样，菌株HSX-5和YQX-8混合发酵酒样中己酸乙酯提升了2倍，菌株HSX-5、YQX-8、MNS-6混合发酵酒样中的辛酸乙酯和乙酸乙酯含量增加［9］。选择4种商业酵母分别为VIC、ADT、CECA、NSD对无核寒香蜜葡萄进行发酵后发现，酵母ADT发酵可显著增加葡萄酒中酯类含量，VIC发酵葡萄酒中萜烯类含量增加，CECA发酵葡萄酒醇类含量多［16］。本研究结果发现，葡萄酒中的主要物质为酯类、酸类和醇类。安琪酵母发酵后酸类物质含量较高，且随着安琪酵母浓度升高，酸类物质的含量先升高后降低，浓度在150 mg/L时酸类物质含量最高。大曲酵母发酵后酯类物质含量较高，且随着大曲酵母浓度的升高而逐渐升高，酯类物质含量在大曲酵母浓度为200 mg/L时最高。综上，不同类型的酵母及不同浓度的酵母均对挥发性物质的数量和含量有着巨大的影响。

4 结论

本研究所有处理中共鉴定出155种挥发性物质，葡萄酒中的主要醇类和酯类物质分别为异戊醇和乙酸乙酯。在安琪酵母和大曲酵母发酵的葡萄酒中，分别鉴定出117种和95种挥发性物质；两种酵母在浓度相同的情况下，安琪酵母发酵后所鉴定到的挥发性物质数量也明显多于大曲酵母，利用安琪酵母发酵后可获得更多的特异性挥发性代谢物，因此，安琪酵母发酵后的葡萄酒可获得更多种类的挥发性物质。所鉴定到的物质可分为9类，通过相对含量和主成分分析，葡萄酒中的主要物质为酯类、酸类和醇类。安琪酵母发酵后酸类物质含量较高，大曲酵母发酵后酯类物质含量较高。酵母的种类和浓度对葡萄酒中挥发性物质的数量和相对含量均有较大的影响。

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收稿日期：2024-03-10

基金项目：红河学院大学生创新训练项目（CX2022173）；红河学院科研基金博士专项项目（XJ22B12）

第一作者简介：陈佳富（2002-），男，硕士，主要从事园艺植物次生代谢物研究。E-mail：chenjfu616@163.com

*通信作者：付鸿博（1987-），男，讲师，博士，主要从事果树种质资源创新利用与分子育种工作。E-mail：113311168@qq.com