高特异性σ2R/TMEM97 配体FEM-1689 可减轻神经病理性疼痛并抑制整合应激反应

1.重要意义

该研究表明，用一种调节剂靶向σ2R/TMEM97，可以在小鼠模型中降低疼痛超敏性，且具有精确的选择性。研究还发现整合应激反应(ISR)的抑制是一种潜在的作用机制，它将受体与细胞信号事件联系在一起，在临床前和临床上验证了这种机制对缓解疼痛的作用。该研究表明，σ2R/TMEM97 可以被特定的小分子选择性地结合，从而在对神经病理性疼痛至关重要的细胞亚群中产生ISR 抑制作用。因此，σ2R/TMEM97 靶向疗法有可能在非阿片受体的情况下有效地缓解疼痛。

2.背景

神经病理性疼痛是由躯体感觉神经系统的损伤或疾病引起的，影响的人数约占总人口的10%，是造成严重慢性疼痛的主要原因。神经病理性疼痛的治疗是一项重大的临床挑战，因为现有药物不仅疗效有限，而且还会产生严重的不良反应。目前急需能通过非阿片类药物和非成瘾机制缓解神经病理性疼痛并改善不良反应的新型药物。

2017 年，σ2受体(σ2R)被确认为跨膜蛋白 97(TMEM97)。该研究发现，几种选择性与σ2R/TMEM97结合的小分子能在小鼠体内产生强烈而持久的抗神经损伤引起的神经病理性疼痛效应，这一发现被结构不同的分子独立复制。尽管σ2R/TMEM97 的生物功能尚不十分清楚，但它是一种与内质网相关的跨膜蛋白，在钙信号转导和胆固醇转运及稳态中发挥作用。20(S)-羟基胆固醇最近被确定为σ2R/TMEM97 的内源配体。σ2R/TMEM97 的作用主要集中于癌症，但它也与包括阿尔茨海默病和帕金森病在内的神经退行性疾病有关。在许多神经退行性疾病模型中，包括创伤性脑损伤、亨廷顿病和视网膜神经节细胞变性，药物作用于σ2R/TMEM97靶点具有神经保护作用。

调节σ2R/TMEM97 缓解神经病理性疼痛的机制尚不清楚。鉴于σ2R/TMEM97 位于内质网，该研究验证假设σ2R/TMEM97 靶向是否可通过干扰包括内质网应激反应在内的ISR 来缓解疼痛。ISR 是对细胞应激源的一种适应性反应，如错误折叠蛋白的堆积、脂质和氧化应激、氨基酸和血红蛋白匮乏以及病毒感染。与ISR 相关的一个典型信号事件是真核生物启动因子 2α (eIF2α)在细胞应激反应中被磷酸化，这种磷酸化由4种激酶传递：蛋白激酶 R (PKR)、蛋白激酶R 样内质网激酶、血红蛋白调节抑制因子(HRI)和蛋白GCN2。eIF2α 的磷酸化会抑制全局蛋白质合成，并促进mRNA 的翻译，例如活化转录因子 4 (ATF4)。该研究表明，ISR 的诱导与创伤性神经损伤、代谢紊乱和自身免疫性疾病引起的神经病理性疼痛有关。

另一个关键问题是，σ2R/TMEM97 配体的抗神经病理性疼痛作用是否特异归因于它们与 σ2R/TMEM97 的结合，因为这类化合物在σ1 受体上也能产生巨大活性，并且该受体在动物模型中对抗疼痛具有促进作用。该研究使用Tmem97基因敲除 (KO) 小鼠和一种对 σ2R/TMEM97 有更好选择性的小分子 FEM-1689 来检验σ2R/TMEM97 与小鼠神经病理性疼痛模型中的抗痛觉有因果关系这一假设。事实上，FEM-1689 在SNI 模型中的抗疼痛作用在 TMEM97 敲除小鼠中完全消失。该研究还表明，FEM-1689 在小鼠和人类背根神经节(dorsal root ganglion, DRG) 神经元中以σ2R/TMEM97 依赖性方式抑制 ISR。该研究提供了以 σ2R/TMEM97 为靶点作为基础治疗神经病理性疼痛方法的有力机制论证。

3.结果

（1）TMEM97 mRNA 在人和小鼠DRG 中表达：为了评估σ2R/TMEM97 是否在人类痛觉感受器中表达，该研究使用从器官捐献者那里获得的人类DRG进行RNAscope 原位杂交。发现TMEM97在人类所有类型的感觉神经元中均有表达，包括SCN10A(Nav.8) 阳性的痛觉感受器。约70% 的人DRG 神经元表达 SCNI0A 转录物，这与之前的观察结果一致，所有接受评估的神经元均表达TMEM97mRNA。表达 TMEM97 的神经元细胞大小分布矩阵（平均 = 74 μm） 显示，TMEM97mRNA 并不局限于一个亚群。进一步研究发现，FABP7的阳性卫星胶质细胞也表达TMEM97。利用既往发表的人类DRG空间 RNA 测序数据集鉴定并量化了人类 DRG 中表达TMEM97 的神经元亚群。该研究验证了他们的发现，即TMEM97在人 DRG 的所有神经元亚型中均有表达，尤其是在脑啡肽原(PENK)阳性痛觉感受器和 A6 LTMRs 中表达量更高。小鼠 DRG 神经元和卫星胶质细胞表达Tmem97mRNA，其表达模式与人 DRG 几乎相同。此外，之前发表的小鼠单细胞 RNA 测序数据显示，Tmem97在所有 DRG 神经元亚型中均有表达，尤其是在非肽能神经元、施万细胞和卫星胶质细胞中的表达量更高。最近开发的啮齿动物、非人灵长类动物和人类 DRG 的统一数据集显示，TMEM97在所有感觉神经元类型中均有表达。

（2）鉴定FEM-1689 为强效σ2R/TMEM97 结合配体：甲苯并唑类药物和去苯唑类药物代表了生物活性配体的两种不同化学类型，包括 UKH-1114、JVW-1034、SAS-0132 和DKR-1677，它们都能选择性地结合σ2R/TMEM97。第一组包括 UKH-1114，它能缓解小鼠神经病理性疼痛模型中的机械超敏反应，并降低亨廷顿病模型中神经元的毒性。基于UKH-1114 在神经病理性疼痛模型中的积极治疗效果，该研究对其化学结构进行了修改，以找到具有更好结合特性和理化性质的亲脂性更低的类似物，合成了比 UKH-1114 少一个亚甲基的 FEM-1689，发现它是一种具有高选择性和更好理化性质的化合物。除了σ1R（10 倍）和去甲肾上腺素转运体（NET；24 倍）外，FEM-1689 对σ2R/TMEM97 的选择性比40 种中枢神经系统蛋白高 100 倍以上。

（3）FEM-1689 对雄性和雌性小鼠的抗痛觉效应需要完整的Tmem97基因：一个尚未解决的重要问题是σ2R/TMEM97 配体是否会特异地降低疼痛超敏性通过作用于σ2R/TMEM97。为了解决这个问题，该研究使用了一种TMEM97 全基因敲除小鼠。雄性和雌性 TMEM97 敲除小鼠与野生型小鼠具有相似的爪机械敏感性 (vonFrey) 、爪热敏感性（热辐射实验）和爪冷敏感性（丙酮）反应，这表明 TMEM97 的缺失并没有改变它们的基线感觉。 TMEM97 全身敲除小鼠在 SNI 之后是否会发展出增强或减弱的机械性神经病理性疼痛表型，在神经损伤后第 7、10和14 天进行敏反应。在神经损伤后 30 天进行测试时，小鼠仍对机械过敏。对雌雄野生型和 TMEM97全身敲除小鼠进行单次静脉注射 FEM-1689 处理，剂量为 10 mg/kg（该剂量根据既往对结构相似的σ2R/TMEM97 配体UKH-1114 的研究确定）。连续7 天每日评估TMEM97 全身敲除和野生型小鼠诱发的机械阈值，发现两组的机械敏感性几乎没有变化。在用 20 mg/kg 的高剂量 FEM-1689 对小鼠进行第2次治疗之前，先让小鼠恢复2 周。研究发现，这种较高剂量的FEM-1689 一次给药可有效逆转雄性和雌性野生型小鼠的机械超敏反应，持续时间约为 4天。值得注意的是，FEM-1689 未能降低 TMEM97全身敲除小鼠的机械超敏反应，这表明FEM-1689的作用依赖于σ2R/TMEM97。该研究也对雄性和雌性小鼠的 FEM-1689 作用大小进行了量化测量。

（4）FEM-1689 抑制ISR 并促进神经元的生长，依赖于σ2R/TMEM97：该研究旨在阐明 FEM-1689通过与σ2R/TMEM97 结合而作用于感觉神经元的机制。既往研究表明，σ2R/TMEM97 与胆固醇合成和运输、加工之间存在联系，而胆固醇合成和运输过程受到 5'单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)及其底物乙酰辅酶A 羧化酶的严格调控。该研究用不同浓度 (10、100、1000 nM) FEM-1689 处理培养的小鼠DRG 神经元，与目标结合(K = 17 + 8 nM)一致，处理时间为16 h，结果发现p-ACC 水平没有变化，而已知的AMPK 激活剂 A769662 (100 μM) 却能提高野生型和TMEM97 全身敲除神经元的 p-ACC水平。结果显示，FEM-1689 并不影响AMPK-p-ACC通路，因此一定还存在另外一种抗镇觉通路。

随后，检验了FEM-1689 是否会抑制在DRG神经元中的ISR 这一假说。多种证据支持这一假说：①σ2R/TMEM97 和 ISR 转导因子，如蛋白激酶R样内质网激酶 (PERK) ，位于内质网膜上；②最近一份关于20(S)-羟基胆固醇对σ2R/TMEM97 影响的报告涉及内质网-高尔基体网络；③ISR 参与 DRG神经元的创伤诱导和糖尿病神经病理性疼痛。因此，培养了野生型和TMEM97 全身敲除小鼠DRG 神经元，用FEM-1689 处理 16 h，并用免疫细胞化学(ICC)方法测量 p-eIIF2α 水平的变化。ICC测量显示，TMEM97 全身敲除神经元中p-eIF2α 的基础水平远低于野生型神经元。用ISR 抑制剂 ISRIB (200 nM)处理野生型神经元后，p-eIF2α 水平的降低程度与载体和ISRIB 处理的TMEM97 全身敲除神经元中 p-eIF2α水平的降低程度相同。与药物处理的细胞相比，FEM-1689 降低了野生型小鼠DRG 神经元的 p-eIF2α水平，但没有降低TMEM97 全身敲除小鼠DRG 神经元的 p-eIF2α 水平。该研究发现 FEM-1689 在100 nM时最大程度地抑制了 ISR，抑制程度与ISRIB 200 nM相同。该研究计算出 FEM-1689 在野生型小鼠DRG神经元中的 p-eIF2αIC50为30 nM，这与FEM-1689 与TMEM97 的结合亲和力非常相似。

该研究进一步表征了FEM-1689 降低p-eIF2α水平的时间动态，通过在0.5、1、3、6、12 和16 h，用100 nM FEM-1689 处理野生型小鼠DRG 神经并量化p-eIF2α 的免疫反应，由此进一步确定了FEM-1689 降低p-eIF2α 水平的时间动态。 通过这种方法，计算出了FEM-1689 在体外降低p-eIF2α 水平的半衰期为 5 h。用 FEM-1689 处理小鼠 DRG 神经元16 h 后，ISR 的抑制作用达到最大。这一延长的时间与 FEM-1689 延迟和延长的抗痛觉效应一致。FEM-1689 没有降低野生型或 TMEM97 全身敲除小鼠神经元中 BiP（一种对内质网应激和ISR 启动很重要的伴侣）的水平。对培养的小鼠DRG 神经元进行的Sholl 分析表明，FEM-1689 能促进野生型神经元的神经元突起，但不能促进TMEM97 全身敲除神经元的神经元突起。值得注意的是，经药物处理的TMEM97 全身敲除神经元的神经元突起比经药物处理的野生型神经元更明显—这可能是由于TMEM97 全身敲除细胞的ISR 减少，从而促进了蛋白质的合成。这些数据表明，σ2R/TMEM97 是FEM1689 减少ISR 和促进神经元生长所必需的。

（5）去甲苯并吗啡σ2R/TMEM97配体SAS- 0132和DKR-1677 可增强ISR：该研究探讨的下一个问题是，与σ2R/TMEM97 结合的其他化合物是否会抑制ISR，以及ISR 抑制是否是σ2R/TMEM97 调节剂所特有促进抗痛觉的作用。σ2R/TMEM97 调节剂不同的生物学结果可能源于单个配体与蛋白结合位点结合、相互作用方式的差异。同源的哌嗪取代的去甲苯并吗啡SAS-0132 和DKR1677 代表了一种在结构上不同于芳基取代的去甲苯并吗啡 FEM-1689 的化学类型。对 SAS-0132 和 FEM-1689 进行计算对接研究，结果表明这两种调节剂与 σ2R/TMEM97 扩展结合位点的相互作用不同。SAS-0132 具有神经保护作用，但其本身没有抗痛觉作用，之前的研究表明它能抑制 UKH-1114 的抗痛觉作用，而 UKH-1114是 FEM-1689 的同源物。这一观察结果与单个σ2R/TMEM97 调节剂可能发挥不同的、有时是相反的生物效应的假设是一致的。事实上，在用 10、30、100 和300 nM 的 SAS-0132 或DKR1677 处理野生型小鼠 DRG 神经元16 h 后，发现这两种化合物都能促进 eIF2α 的磷酸化，与FEM-1689 的抑制作用形成鲜明对比。这些数据表明，σ2R/TMEM97 结合化合物的不同化学类型对ISR 有不同的影响，可能是通过它们与σ2R/TMEM97 的相互作用方式介导的。

（6）FEM-1689 可抑制 HEK293T 细胞中的ISR：人类胚胎肾脏(HEK) 293 T 细胞表达σ2R/TMEM97（人类蛋白图谱），因此该研究者质疑FEM-1689是否会抑制该细胞系的 ISR。使用 ICC 和分光光度法发现，在FEM1689 处理 2 h 或 16 h 后，p-eIF2α 免疫活性会出现浓度依赖性降低。测试了 FEM-1689在从0.1 nM 至1000 nM 9 种浓度下的作用，在HEK 细胞中测得FEM-1689 在 2 h 和 16 h 处理条件下的 p-eIF2αIC50，分别为 5.9 nM 和 0.7 nM。发现2 h的 FEM-1689 培养期产生了一条具有S 型函数特征的曲线。采用Western 印迹法检测了 FEM-1689 处理对更多 ISR 相关蛋白的影响。用 FEM-1689 处理HEK293T 细胞16 h 后，在BiP 表达保持稳定的情况下，eIF2α、eIF2A 和 p-PERK 的磷酸化呈浓度依赖性减少。表明FEM-1689 影响了 HEK293T细胞中ISR 的PERK-eIF2α 臂，HEK293T 细胞可作为用于开发针对σ2R/TMEM97 的疼痛治疗药物筛选平台。

（7）FEM-1689 逆转甲基乙二醛诱导的机械超敏反应：甲基乙二醛(MGO)是糖酵解的代谢副产物，与糖尿病神经病理性疼痛和其他疼痛性神经退行性疾病有关。该研究试图确定FEM1689 降低p-eIF2α 水平的作用是否能减轻MGO 引起的ISR依赖性机械超敏反应。给野生型小鼠足底注射1次MGO (20 ng) ，使其产生持续6 天的机械超敏反应。一组小鼠在注射MGO 24 h 后接受FEM-1689（20 mg/kg，静脉注射）或ISRIB（2.5 mg/kg，腹腔注射）治疗。在实验的剩余时间内，FEM-1689完全逆转了MGO 诱导的机械过敏性，而ISRIB 的作用则是短暂的。数据显示FEM-1689 可完全逆转MGO 引起的ISR 依赖性痛觉过敏。这证明了开发用于糖尿病神经病理性疼痛的 σ2R/TMEM97 调节剂的实用性。

（8）FEM-1689 在人类感觉神经元中降低p-eIF2α并逆转MGO 诱导的ISR 活性：为了将对啮齿类动物DRG 的研究结果推广到人类，该研究用FEM-1689 对器官捐献者培养的人DRG 神经元进行了 16 h 的处理。与小鼠的数据一致，发现FEM-1689 在浓度为 10 nM 和 100 nM 时能显著降低人类神经元中 p-eIF2α 的水平。然后评估了FEM-1689 是否能逆转人 DRG 神经元中病理 ISR的激活。为了在体外诱导 ISR，用 1 μM 的MGO处理人神经元，这一浓度存在于糖尿病神经病理性疼痛病人的血浆中。MGO 处理会增加人DRG 神经元中peIF2α 的水平，而 FEM-1689 (100 nM)的协同处理会阻止这种增加。这些发现表明与造成神经病理性疼痛刺激有关的ISR 激活可以被σ2R/TMEM97调节剂阻断。

4.讨论

该研究表明，σ2R/TMEM97 配体对小鼠的抗痛觉作用需要σ2R/TMEM97 的直接调节，而不是σ1R或任何其他蛋白或受体。调节σ2R/TMEM97 可抑制小鼠和人类 DRG 神经元的ISR。由于ISR 的减少与疼痛缓解有关，FEM-1689 以及σ2R/TMEM97 抗痛觉作用的细胞机理可能与ISR 的减少有关。最后，发现人类痛觉感受器表达TMEM97基因，而在培养的人DRG 神经元中，FEM-1689 可减少eIF2α 磷酸化，而且使用FEM-1689 可预先抑制人神经元中MGO 诱导ISR。这些结果表明，在疼痛病人中靶向σ2R/TMEM97 可以通过抑制 ISR 来降低机械超敏反应，在小鼠中也观察到了类似的机制。这些发现可将σ2R/TMEM97 作为开发有效治疗神经病理性疼痛的真正靶点。

σ2R/TMEM97 调节剂在小鼠神经病理性疼痛模型中的作用时间过程不同于其他许多起效迅速的抗痛觉化合物。在本研究之前，有两个不同的研究小组使用不同类别的 σ2R/TMEM97 配体在小鼠 SNI 模型中独立观察到了这种缓慢起效的抗痛觉效应。该研究证明了这种效应是由σ2R/TMEM97特异介导的，因为雄性和雌性 TMEM97 全身敲除小鼠完全丧失了抗痛觉活性。这些观察结果表明，σ2R/TMEM97 的信号传递动力学可能是延迟反应的主要根本原因。ISR 通过影响激活转录因子4 (ATF4)和C/EBP 同源蛋白(CHOP)等关键损伤诱导转录因子的翻译来控制基因表达的持久变化。ISR 介导的变化涉及多种转录和翻译后修饰，启动和进展都需要时间。与配体和 σ2R/TMEM97 结合的药代动力学相比，FEM-1689 的起效时间要晚一些，可能就是这个时间过程造成的。Σ2R/TMEM97 调节下游的分子信号传导途径还需要进一步研究。

其他有关 ISR 抑制剂的研究与该研究对FEM-1689 的研究结果之间存在一个重要的差异。该研究注意到 ISR 抑制剂 ISRIB 和 4-PBA 在体内缓解机械过敏反应的疗效持续时间（小时）相对短于FEM-1689（天）。ISRIB 和 FEM-1689 在药效持续时间上的差异可能是由于它们在 ISR 通路上游的作用机制以及每种化合物的药代动力学上的差异造成的。ISRIB 与eIF2B 异源结合并促进其催化活性，eIF2B 是鸟嘌呤核苷酸交换因子，是回收非磷酸化 eIF2 复合物所必需的。在ISR 激活时间长、范围广的情况下，ISRIB 的作用会被削弱。FEM-1689不可能与ISRIB 具有相同的ISR 抑制机制。因此，这些结果表明，FEM-1689 可能提供了一种独特的、比既往观察到的ISRIB 更长期调节 ISR 的方法。

在研究与σ2R/TMEM97 结合的化合物的过程中，该研究发现了几种在多种动物模型中表现出有益效果的化学类型。其中一组包括了芳基取代的甲烷苯并氮杂环丁烷（如UKH-1114 和 W-1034）。UKH-1114 可减轻神经损伤后的机械超敏反应，并可降低亨廷顿病模型中突变亨廷顿蛋白诱导的神经元毒性。甲苯并唑嗪 JVW-1034 不仅能减少两种啮齿类动物酒精依赖模型中的戒断行为，还能缓解小鼠因长期接触酒精而导致的疼痛敏感性升高。UKH-1114 的近似物 FEM-1689 也能减轻神经损伤后的机械超敏反应以及对 MGO 治疗的反应。另一类σ2R/TMEM97 调节剂包括哌嗪取代的苯并吗啡类化合物（如SAS-0132 和 DKR-1677）。值得注意的是，SAS-0132 还能阻断 UKH-1114 的抗痛觉活性，这表明不同的σ2R/TMEM97 结合化合物可能对痛觉有不同的影响。DKR-1677 是SAS-0132 的同源物，在两种不同的创伤性脑损伤模型中具有保护作用。它能减少轴突变性，并在创伤性脑损伤的爆炸损伤模型中提供剂量依赖性的认知能力增强，同时还能在控制性皮层撞击模型中保护少突胶质细胞和皮质神经元。DKR-1677 还能保护视网膜神经节细胞免受缺血/再灌注损伤。该研究证明了SAS-0132 和DKR1677 增加小鼠 DRG 神经元中p-eIF2α 的表达，而FEM-1689 则降低了p-eIF2α 的表达，表明这些化合物对 ISR 有不同的影响。这些研究结果为开发针对σ2R/TMEM97 有效疼痛治疗药物的药物筛选框架奠定了基础。

要了解σ2R/TMEM97 调节剂如何影响ISR 还需要进一步研究，文献中已有各种直接和间接影响ISR 的线索。首先，σ2R/TMEM97 定位于内质网膜可能会通过内质网应激将其与ISR 联系起来，特别是通过影响激酶PERK 对eIF2α 的磷酸化。事实上，在 FEM-1689 处理 HEK 细胞后，P-PERK 在 p-eIF2α和 eIF2A 最大程度降低的浓度下减少，这表明σ2R/TMEM97 与PERK 途径之可能存在联系。其次，σ2R/TMEM97 很可能参与了生物活性脂质（如羟基胆固醇）在细胞间的转运，也许是通过像尼曼病C1(NPC1)蛋白那样的转运活性。过多的脂质摄入和增加脂质合成的需求会促进ER 的脂质应激，已知这种应激会激活ISR 的PERK-eIF2α 分支并损害线粒体功能。最后，σ2R/TMEM97 通过影响贮存操作的钙离子进入调节细胞 Ca2+动态。ER 是细胞中最大的 Ca2+储存库，对引起ER 应激和 ISR 诱导的 Ca2+水平波动非常敏感。目前还不清楚 FEM-1689 的抗痛觉作用是否需要一种或多种与抑制 ISR 有关的机制。然而，这种与 ISR 抑制的联系有助于进一步探索σ2R/TMEM97 调节剂在 DRG 神经元中的下游机制作用。

神经元生长能力可用于评估药物的神经调节、神经保护和神经再生作用。该研究结果表明，FEM-1689可通过 Sholl 分析测量，以 σ2R/TMEM97 依赖性方式促进神经元的生长和复杂性。与未接受任何药物治疗的野生型神经元相比，缺乏σ2R/TMEM97 的神经元也显示出更强的神经元生长能力。这是因为ISR 水平降低，TMEM97 全身敲除神经元的蛋白质合成在基础水平上未受抑制。轴突生长是一个需要蛋白质合成的过程，因此在这些条件下抑制 ISR 与蛋白质合成的增强效应是一致的。鉴于发现的对轴突生长的影响，评估σ2R/TMEM97 配体是否能在体内产生这种效应，以及是否能导致神经感受器对皮肤的适当再神经支配，避免与神经病理性疼痛相关的触觉小体的异常靶向，将是非常重要的。

该研究结果解释了有关用小分子调节σ2R/TMEM97 可产生抗痛觉效应的机理起源的解读。但仍有一些问题尚未解决。首先，必须确定ISR 激活与FEM-1689 体内抗痛觉作用之间的明确联系。一种方法是评估Eif2s1-KO 小鼠的神经病理性疼痛。这种实验较复杂，因为Eif21编码的 eIF2α 缺失或通过点突变完全阻止eIF2α 磷酸化是致死的。此外，尚未发现eIF2α 的特异性拮抗剂。目前广泛使用的抑制 ISR 化合物有化学物质、ISR 激酶抑制剂和 eF2B 稳定剂（如ISRIB），它们非特异性作用于 eIF2α，因此不是解决这一问题的最佳工具。其次，目前还不清楚为什么TMEM97 全身敲除神经元在基线时的 p-eIF2α 比WT 神经元少。这就出现了一个悖论：σ2R/TMEM97（即TMEM97 全身敲除）的永久“拮抗”和 FEM-1689 对σ2R/TMEM97 的调节都会导致 p-eIF2α 水平的降低。此外，σ2R/TMEM97结合化合物的信号作用可能取决于所测量的途径。第三， FEM-1689 可能具有某些多药理作用，因为它能明显结合σ1 受体(Ki = 167±54 nM)和NET(Ki = 405±227 nM) ，尽管其效力分别比σ2R/TMEM97低10 倍和24 倍(Ki = 17±8 nM)。由于FEM-1689对TMEM97 全身敲除小鼠的抗神经中枢兴奋作用被完全抑制，该研究得出结论，FEM-1689 在体内的作用是由σ2R/TMEM97 而非σ1 受体、NET 或其他受体介导的。此外，σ1 受体拮抗剂和 NET 抑制剂可分别在急性期（数小时）或亚急性期（数天至数周）内减轻痛觉过敏反应，这两者都不符合对FEM-1689 的观察结果。然而现阶段还不能排除多药理学的可能性。第四，必须确定 FEM-1689 的活性是外周还是中枢部位的作用。虽然他们的药代动力学实验显示该化合物很容易进入大脑，但研究结果也显示FEM-1689 在体外抑制了小鼠和人类DRG 的ISR。未来的实验将使用一种正在开发的痛觉感受器特异性TMEM97 敲除小鼠来解决这一重要问题。