中晚期非小细胞肺癌患者外周血淋巴细胞亚群特点分析

李雅楠 张志 张玉娜 白明明 郑凡 邢江涛 黄怀鹏 吴克峰

在全球范围内,肺癌的发病率仅次于乳腺癌,据统计,2020年约有180万人死于肺癌,位居癌症相关死亡的首位[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)约占肺癌的85%[2],其最常见的组织类型为腺癌和鳞癌,分别占50%和40%[3]。研究表明,晚期NSCLC患者外周血中存在循环肿瘤细胞[4]。免疫监视功能下降有助于循环肿瘤细胞逃避免疫细胞的杀伤作用,并在靶器官中形成转移性病变[5]。本研究观察NSCLC患者外周血淋巴细胞亚群的分布特点,报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2022年1月至2023年4月就诊于石家庄平安医院肿瘤学部,符合入组标准的肺癌患者,收集治疗前1 d患者的外周静脉血及临床病例资料。本研究经石家庄平安医院医学伦理委员会批准(批件号:202112)。

1.2 纳入标准 (1)无恶性肿瘤病史;(2)1个月内新发肺占位患者;(3)符合中华医学会肿瘤学分会肺癌临床诊疗指南(2021版)肺癌诊断标准[6];(4)未接受肺癌相关手术、化疗、放疗、免疫治疗、靶向治疗、类固醇激素治疗;(5)经支气管镜咬检或经皮穿刺肺组织活检,病理证实为肺部原发肿瘤,且组织病理类型为鳞癌或腺癌;(6)无急性及严重播散性感染性疾病;(7)无自身免疫性疾病;(8)排除合并其他部位原发肿瘤者。

1.3 主要仪器与试剂 CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP-Cy5.5/CD4-PC7/CD19-APC/ CD8-APC-Cy7荧光单克隆抗体试剂盒购自天津旷博公司,溶血素购自美国Becton Dickinson公司。流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司FACS Canto Ⅱ流式细胞仪,每样本管获取10万个活细胞,流式分析软件为BD Diva 8.0.2。血液分析仪为日本Sysmex公司XS-1000i全自动五分类血液分析仪。

1.4 标本收集及实验方法 真空采血管采集患者外周静脉血2 mL。按照CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP-Cy5.5 /CD4-PC7/CD19-APC/CD8-APC-Cy7荧光单克隆抗体试剂盒说明书进行样本处理,然后上机检测。首先,建立CD45/SSC散点图,去除碎片,设置不规则门圈出CD45高表达、SCC低表达的淋巴细胞。选择显示淋巴细胞门细胞,分别设置CD3/SSC散点图、CD3/CD4散点图、CD3/CD8散点图、CD3/CD16+56散点图和CD3/CD19散点图。在CD3/SSC散点图中,设置方形门将表达该抗原的阳性细胞群圈出,即总T细胞占淋巴细胞的百分比。在CD3/CD4、CD3/CD8、CD3/CD16+56和CD3/CD19散点图中,设置四象限门,将表达相应抗原的阳性细胞圈出,即CD4+T、CD8+T、NK、B细胞占淋巴细胞的百分比。各淋巴亚群绝对值(个/μL)=各淋巴细胞占淋巴细胞的百分比×血常规淋巴细胞绝对值。见图1。

图1 外周血淋巴细胞亚群流式检测

2 结果

2.1 一般资料 本研究共纳入93例新发肺癌病例,其中男74例,女19例;年龄41～87岁,平均年龄(67.02±8.99)岁。经组织病理学证实,42例(45.16%)为鳞癌,51例(54.84%)为腺癌。见表1。

表1 93例新发肺癌病例的临床特征

2.2 肺癌患者外周血淋巴细胞亚群特征

2.2.1 58.06%的病例外周血淋巴细胞比例低于正常值下限,其中腺癌病例中,淋巴细胞比例低于正常值下限者占52.94%,鳞癌病例中,淋巴细胞比例低于正常值下限者占64.29%,差异无统计学意义(P=0.30);35.48%的病例淋巴细胞绝对值低于正常值下限,其中腺癌病例中,淋巴细胞绝对值低于正常值下限者占33.33%,鳞癌病例中,淋巴细胞绝对值低于正常者占38.10%,差异无统计学意义(P=0.67)。见表2。

2.2.2 流式分析显示,与健康人群数据相比,总T细胞比例高于正常值上限者占7.53%,低于正常值下限者占7.53%。细胞毒T细胞比例高于正常值上限者占7.53%,低于正常值下限者占7.53%。辅助T细胞比例高于正常值上限者占21.51%,低于正常值下限者占9.68%。总B细胞比例高于正常值上限者占7.53%,低于正常值下限者占16.13%。NK细胞比例高于正常值上限者占3.23%,低于正常值下限者占4.30%。腺癌和鳞癌在以上指标的分布上差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2.3 总T细胞绝对值低于正常值下限者占60.22%,细胞毒T细胞绝对值低于正常值下限者占64.52%,辅助T细胞绝对值低于正常值下限者占58.06%,总B细胞绝对值低于正常值下限者占44.09%。腺癌和鳞癌在以上指标的分布上差异均无统计学意义(P>0.05)。NK细胞绝对值低于正常值下限者占32.26%,其中21.57%的腺癌病例NK细胞绝对值低于正常值下限者,45.24%的鳞癌病例NK细胞绝对值低于正常值下限者,差异有统计学意义(P=0.02)。见表2。

2.3 不同病理类型患者外周血淋巴细胞亚群具体数值的分布情况:腺癌患者的总T细胞比例显著低于鳞癌患者的总T细胞比例(P=0.047),腺癌患者的NK细胞比例显著高于鳞癌患者的NK细胞比例(P=0.0025),腺癌患者的NK细胞绝对值显著高于鳞癌患者的NK细胞绝对值(P=0.02),其他淋巴细胞亚群检测指标差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

3 讨论

免疫状态与宿主肿瘤的发生发展密切相关。健康人群的外周血可以检测到多种免疫细胞,包括T细胞、B细胞和NK细胞,它们在免疫监视、免疫抑制和杀伤效应等方面发挥关键作用[5]。研究发现,循环肿瘤细胞在进入外周循环后可抱团形成循环肿瘤细胞簇[7]。循环肿瘤细胞簇的形成能提高其侵袭转移能力,程序性死亡受体配体1(programmed cell death ligand 1, PD-L1)在肺癌细胞的表达能够使其逃离免疫细胞的杀伤作用,从而产生免疫耐受[8]。循环肿瘤细胞与NSCLC患者外周血免疫监视功能下降有关。免疫监视功能降低有助于其逃避免疫细胞的杀伤作用,并在靶器官中形成转移性病变[5]。因此,机体免疫细胞亚群在数量或比例上的变化至关重要。

本研究结果显示,大部分中晚期NSCLC患者在就诊初期外周血淋巴细胞亚群比例正常(总T细胞84.95%、总B细胞76.34%、NK细胞92.47%),但由于淋巴细胞占白细胞的比例降低和绝对值减少,因此总T细胞绝对值、总B细胞绝对值和NK细胞绝对值相应降低。这提示中晚期NSCLC患者外周血免疫功能低下,与肿瘤的发生发展密切相关。

T细胞是具有高度异质性的细胞群体,其中CD4+T细胞和CD8+T细胞占比最大。本研究发现,在就诊初期,中晚期肺癌患者外周血已存在CD4+T和CD8+T细胞比例失衡。研究报道,肿瘤间质中CD4+/CD8+T细胞的浸润与NSCLC患者的预后及生存率密切相关[9]。NSCLC肿瘤部位CD4+T细胞数量较邻近正常肺组织的CD4+T细胞数量显著增多,以CD4+Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cell,Tregs)细胞为主。CD8+T细胞是抑制肺癌生长的关键细胞,其生物学效应被CD4+Foxp3+Tregs细胞抑制[10]。可见,CD4+/CD8+比例失衡可能破坏免疫系统网络,促进肿瘤细胞的免疫逃逸或免疫耐受。

NK细胞称为自然杀伤细胞,起源于共同淋巴祖细胞,与T、B细胞不同,它们无需抗原预先致敏,可以直接杀伤某些肿瘤细胞,也可以通过ADCC效应定向杀伤IgG抗体特异性结合的肿瘤细胞,是执行机体免疫监视作用的重要效应细胞[11]。NK细胞还可以通过与其他免疫细胞相互作用来调节免疫反应,例如将凋亡靶细胞的抗原交叉提呈给特定的树突细胞,以及通过产生γ-干扰素来启动CD4+T细胞[12]。本研究表明,腺癌患者的NK细胞比例和绝对值均显著高于鳞癌患者水平。流行病学显示,石家庄市肺腺癌和肺鳞癌的5年生存率分别为40.06%和24.51%[13]。提示高NK细胞状态可能是腺癌患者的保护因素。文献报道,循环肿瘤细胞阳性患者外周血NK细胞比例显著低于循环肿瘤细胞阴性患者相应水平[5]。免疫紊乱导致肿瘤细胞扩散到循环中,逃避免疫细胞的杀伤,并迁移到靶器官后形成转移灶,最终导致疾病进展和生存率低下。

综上所述,中晚期NSCLC患者就诊初期外周血T、B、NK细胞比例多正常,但各亚群细胞绝对值减低,CD4+/CD8+比例失衡,腺癌患者NK细胞水平显著高于鳞癌患者NK细胞水平。由于肺癌患者早期临床症状不明显,大部分患者出现临床症状时已处于晚期。