苦碟子总黄酮基于PI3K/AKT信号通路对冠心病心绞痛大鼠血管内皮功能的影响

曾静 雷玉华 杨淑蓉 华晓芳 周慧 黄晶

冠心病也称为“冠状动脉性心脏病”,该病的产生与冠状动脉粥样硬化紧密相关,容易使机体冠脉血管腔内出现阻塞、痉挛及狭窄,当心肌缺血缺氧时常常会出现心绞痛,当心肌坏死时则会进展为心肌梗死,在>40岁的中老年人群中比较多见,尤其是处于脑力工作者占大多数且随着国内经济、社会逐渐发展,人民的生活质量提升、饮食习惯转变以及人口的老龄化情况,该病对人们身体健康造成严重危害的常见病,其死亡率及患病率呈不断上升的趋势,且患病年龄逐步趋于年轻化[1-3]。而冠心病心绞痛属于医学“心痛”、“胸痹”的范畴内,在中医上将症状特征常归纳为胸痛、胸闷窒息、喘息严重、悲痛彻心等[4-5]。苦碟子总黄酮属于中药苦碟子内所提取的有效成分,有研究发现,苦碟子注射液在治疗冠心病心绞痛中获得了比较明显的效果,但具体何种成分起到作用尚未清晰[6]。基于此,本文采用苦碟子总黄酮对冠心病心绞痛大鼠病症予以干预,效果显著,其机制可能与PI3K/AKT信号通路相关,报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取SPF级45只SD大鼠,体重17～25 g,平均(21.45±2.60)g,由深圳湾实验室提供,动物许可证号:SYXK(粤)2022-0287,所有大鼠均在湿度40%～65%,温度20～23℃的标准鼠笼里饲养,光照24 h,明暗交替12 h,饲养过程中大鼠自主饮食。适应性饲养5 d后进行试验。本试验均严格按动物实验标准操作,且获得医院委员会批准。

1.2 药品 苦碟子总黄酮由通化华夏药业有限责任公司提供,纯度≥90%,应用时选取无菌0.9%氯化钠溶液配制相应浓度的苦碟子总黄酮溶液,需注意现用现配,并储存于干燥、密封避光的环境中。

1.3 方法

1.3.1 建模与分组:在适应性喂养5 d后选取20只作为对照组,其余65只参照文献[7]建立冠心病心绞痛模型,用自制的高脂饲料持续性喂养10周,高脂饲料为正常的饲料内放入3%的胆固醇(TC)、0.5%的胆酸钠、10%的蛋黄粉、10%的猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶,35 g/d。对照组大鼠使用正常的饲料养育,35 g/d。后在大鼠尾静脉抽血做样本,采取动物自动生化分析仪(厂家:山东博科科学仪器有限公司,型号:BK-200VET型)测定大鼠总胆固醇(TC)、三酯甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)表达予以证实模型建立成功,共60只大鼠建模成功,将建模成功的60只大鼠随机分为模型组、苦碟子总黄酮低剂量组、苦碟子总黄酮高剂量组3组,每组20只。

1.3.2 给药干预:建模完成后,开始进行给药。对照组、模型组予以注射用水(4 mL)进行灌服,苦碟子总黄酮低剂量组给予注射用水+1.0 mg/mL苦碟子总黄酮进行灌胃,苦碟子总黄酮高剂量组给予注射用水+2.0 mg/mL苦碟子总黄酮进行灌胃。1次/d,连续饲养10周,观察大鼠情况。

1.4 观察指标

1.4.1 样本采集:收集大鼠心脏中5 mL的血液样本,以离心半径6 cm、转速2 500 r/min,离心处理15 min,提取上层血清,-65℃低温环境存储备检。在大鼠腹部注入戊巴比妥后断颈处死,取其心脏,收集周围结扎的心肌组织,制成样本,于-75℃冰箱内保存,备用。

1.4.2 病理组织学观察:取大鼠心肌组织,放进4%多聚甲醛溶液内予以固定,并使用梯度乙醇脱水,埋于石蜡内,制作切片,厚度为3 μm,后制作成玻片标本,放入苏木精于室温状态下培养10～15 min,滴加0.5%的曙红溶液在室温状态下培养3～5 min,应用HE染色试剂盒进行染色,于光镜下观察病理组织的形态学变化。

1.4.3 血管内皮功能、心肌酶、炎性因子指标表达检测:采用ELISA法检测一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LD)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)水平,首先经包被液将蛋白稀释至最佳含量,保持5℃过夜后,待检,后经反复冲洗、稀释,洗3～5次,4 min/次,上述步骤反复试验3～5次,后放入终止制剂发生反应,使用酶标仪(厂家:山东三体仪器有限公司,型号:ST-MB96S)测量460 mm处的吸光值,依据标准的曲线观察并计算4组大鼠NO、ET-1、CK-MB、LD、TNF-α、IL-6表达水平,试剂盒分别由优利科(上海)生命科学有限公司、博辉生物科技(广州)有限公司、艾美捷科技有限公司、北京伊塔生物科技有限公司提供,货号分别为YLK-EDS001、EK-R37841、GBS-IT7209、SY6352、GBS-IT7716、GBS-IT6570进行检测。其检测步骤均由专业医师按说明书操作进行。

1.4.4 PI3K/AKT信号通路蛋白相对表达量检测:采用免疫印迹法测定4组大鼠心肌组织中PI3K、Akt水平表达,取4组大鼠心肌组织,冰上溶解约15 min后,以100 mg∶1 mL的比例置于相应体积的蛋白清液内进行裂解反应,于5℃静置3～5 min后,将4组样本放入匀浆机中使其均匀的研磨加以萃取总蛋白,应用BCA法对蛋白液体含量进行测定,试剂盒由(天根生化科技(北京)有限公司,货号:PA115-01)提供,计算样本数据,后取含量为45 μg的总蛋白样本用凝胶(10%)行电泳分离(75～125V,90～100 min),后在100 mV的稳定电压下和PVDF膜行湿转移,加入牛血清白蛋白(5%)在室温状态下培养1 h,后将以1∶500比例稀释的PI3K、Akt放进分离后的蛋白质内,于5℃下培养过夜后,接着在冲洗后于室温环境下滴入二抗培养1 h,放于显示仪下,加入化学发光制剂,进行1～2 min显影后操作,获取数值,重复试验3次。内参为β-actin。应用Image J软件分析4组SPF级大鼠相对应的条带灰度值。

2 结果

2.1 病理组织学观察 对4组大鼠心肌组织切片染色用光镜观察,对照组的心肌细胞形态正常、结构较为完整、细胞核均匀染色,心肌纤维整齐排列,无显著变化;模型组细胞核缩小或消失,心肌细胞发生变性,部分心肌纤维出现断离,散乱排列心肌间质中存在较多的炎性细胞入侵,伴有水肿、充血情况;苦碟子总黄酮低、高剂量组相较于模型组,心肌纤维排列、心肌细胞结构形态有所改善,充血、炎症及水肿情况明显缓轻。见图1。

对照组 模型组 苦碟子总黄酮低剂量组 苦碟子总黄酮高剂量组

2.2 4组大鼠血管内皮功能表达比较 与对照组比较,模型组、苦碟子总黄酮低剂量组的ET-1表达升高,NO表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,苦碟子总黄酮低、高剂量组的ET-1表达降低,NO表达上升,差异有统计学意义(P<0.05);与苦碟子总黄酮低剂量组比较,苦碟子总黄酮高剂量组的ET-1表达下降,NO表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠血管内皮功能表达比较 n=20,

2.3 4组大鼠心肌酶水平表达变化比较 与对照组比较,模型组、苦碟子总黄酮低剂量组的CK-MB、LD表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,苦碟子总黄酮低、高剂量组的CK-MB、LD表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);与苦碟子总黄酮低剂量组对比,苦碟子总黄酮高剂量组的CK-MB、LD表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠心肌酶水平表达变化比较 n=20,U/L,

2.4 4组大鼠炎性因子水平表达变化比较 与对照组比较,模型组、苦碟子总黄酮低、高剂量组的TNF-α、IL-6表达上升,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,苦碟子总黄酮低、高剂量组的TNF-α、IL-6表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与苦碟子总黄酮低剂量组比较,苦碟子总黄酮高剂量组的TNF-α、IL-6表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 4组大鼠血清炎性因子表达变化比较 n=20,pg/mL,

2.5 4组大鼠PI3K/AKT信号通路蛋白相对表达量 与对照组比较,模型组、苦碟子总黄酮低、高剂量组PI3K、AKT表达均有所下降,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,苦碟子总黄酮低、高剂量组的PI3K、AKT表达均有所升高,差异有统计学意义(P<0.05);与苦碟子总黄酮低剂量组比较,苦碟子总黄酮高剂量组PI3K、AKT表达均有所升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4,图2。

表4 4组大鼠PI3K/AKT信号通路蛋白相对表达量 n=20,

图2 PI3K/AKT信号通路蛋白Western blot图;A 对照组;B 模型组;C 苦碟子总黄酮低剂量组;D 苦碟子总黄酮高剂量组

3 讨论

出现在冠状动脉中的栓塞、创伤、结缔性组织疾病、先天性畸形及炎症等均会使心肌缺氧、缺血,上述症状广义而言均属冠心病范围。世界卫生组织对冠心病常分为五大类别,包括心绞痛、无病灶心肌缺血、心肌梗死、猝死及缺血性心脏病[8-10]。中西医诊治冠心病心绞痛主要包含以下内容:调整饮食习惯;少盐清淡;对高血糖、高血压及高血脂等症状给予有效的抑制;实施针灸或药物的诊疗;重建血管进行治疗等方面[11-12]。

苦碟子总黄酮属于中药苦碟子内的黄酮类化合物,其有抗肿瘤、抗氧化应激等作用,可用于治疗心脑血管系统病症,且通过苦碟子注射液还可通过改善循环、血管扩张等途径起到“化瘀活血”的效果,可有效改善心脏功能、缓解心脏血氧供应。苦碟子注射液能提升治疗冠心病心绞痛的效果,但其除黄酮类化合物外,还包括腺苷等成分,而有关苦碟子总黄酮对冠心病作用的研究相对偏少[13]。ET-1、NO通过血管内皮细胞产生有较强拮抗作用的活性物质,为反映血管内皮功能的主要指标,二者比例紊乱可加重冠心病病症的进展;且ET-1可造成冠状动脉痉挛加剧,有导致心律失常、细菌细胞毒性作用;NO是一种血管舒张的重要因子,是通过分子氧及L-精氨酸在NO合成酶的刺激下产生[14]。CK-MB、LD均属于心肌损伤有关的酶学指标,CK-MB主要分布在骨骼、心肌及平滑肌等组织细胞中,为评估心肌损伤程度的重要指标,可作为检测冠心病的一种酶;LD为一类糖酵解酶,存在于所有组织细胞的细胞质中,心肌细胞内的活性相较于血清明显升高,心肌细胞受损时可释放至血液中,致使血液中水平上升,可作为评估心肌受损主要的非特异性指标[15]。IL-6、TNF-α是炎性反应加重、启动因子,与动脉粥样硬化发生及斑块的稳定性密切相关,促进血管壁中炎性反应,促使动脉粥样硬化产生,加速冠心病发展[16]。本研究发现,与对照组比较,模型组、苦碟子总黄酮低剂量组的ET-1、CK-MB、LD、TNF-α、IL-6表达升高,NO、PI3K、AKT表达降低(P<0.05);与模型组比较,苦碟子总黄酮低、高剂量组的ET-1、CK-MB、LD、TNF-α、IL-6表达降低,NO、PI3K、AKT表达上升(P<0.05),与有关学者[17]研究较相似。表明苦碟子总黄酮在冠心病心绞痛大鼠治疗中可以有效调节机体中血管内皮功能,改善心肌酶水平,降低炎性反应,为临床治疗提供了有利参考。

PI3K属于一类细胞中具有特异性催化磷脂酰肌醇的重要激酶,PI3K/AKT信号通路平衡失调常见于多项人类病症中,包含心血管病症、癌症、神经性病症及糖尿病[18]。AKT属于一种在细胞中存活的主要调节性因子,可通过直接抑制蛋白凋亡或减缓转录因子产生促使凋亡得以有效调节[19]。本研究发现,在冠心病心绞痛大鼠机体中PI3K、AKT表达降低,通过苦碟子总黄酮对其进行干预,可使PI3K、AKT表达显著上升,由此证实其作用机制与PI3K/AKT信号通路有一定关系。研究显示,药物在病情治疗中,可通过对PI3K/AKT信号通路进行激活,有效降低TNF-α、IL-6表达,从而发挥心肌细胞保护作用,调节心肌细胞的病变程度,调节ET-1、NO表达,以改善血管内皮功能,最终起到治疗冠心病心绞痛的作用[20-21],与本研究结果相似。表明通过苦碟子总黄酮对PI3K/AKT表达进行调控,能有效降低冠心病心绞痛大鼠体内的氧化应激反应,改善血管内皮功能,提升心肌细胞血供,减缓炎性反应,降低心肌细胞受损程度,促使病症改善。

综上所述,苦碟子总黄酮可通过调节PI3K/AKT信号通路降低炎性反应,进而改善机体血管内皮功能及减缓心肌组织损伤,对冠心病心绞痛大鼠起到有效缓解的作用。